全自动蛋白质纯化系统装置及其用途.pdf
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(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 111574584 A (43)申请公布日 2020.08.25 (21)申请号 202010434072 .2 (22)申请日 2020 .05 .21 (71)申请人 中国科学院生物物理研究所 地址 100101 北京市朝阳区大屯路15号 (72)发明人 欧先金 李雪梅 (74)专利代理机构 北京植德律师事务所 11780 代理人 唐华东 (51)Int .Cl . C07K 1/16(2006 .01) C07K 1/14(2006 .01) 权利要求书1页 CN 111574584 A (54)发明名称 全自动蛋白质纯化系统装置及其用途 (57)摘要 本发明公开了一种全自动蛋白 质纯化系统 装置， 其包括层析装置( 0 )、第一驱动装置、 连接 管路(2)、 定位装置(3)、 第二驱动装置、 第一容器 (5)、 第二容器(6)、 第一阀门、 第二阀门及其控制 装置。 所述全自动蛋白质纯化系统装置能够完全 设备结构简 自动化地完成蛋白质层析纯化操作， 单， 成本低廉， 对样品液品质要求低， 不会出现管 路堵塞等问题， 适用性广， 可大大提高生物领域 蛋白质层析纯化的自动化和降低人工投入。 说明书5页 附图2页 CN 111574584 A 权 利 要 求 书 1/1 页 1 .一种全自动蛋白 质纯化系统装置 ，其包括层析装置(0) 、第一驱动装置、连接管路 (2)、定位装置(3)、第二驱动装置、第一容器(5)、第二容器(6)、第一阀门、第二阀门及其控 制装置， 连接管路(2)一端连接于层析装置(0) ， 另一端连接于定位装置(3)上， 第二驱动装 置驱动定位装置(3)， 第一容器(5)通过第一两通阀经由管路与层析装置(0)上部连接， 第二 容器(6)通过第二两通阀经由管路与层析装置(0)上部连接， 其特征在于， 所述第一驱动装 置驱动第一容器(5)中的溶液流经层析装置(0) ， 流穿的液体通过连接管路(2)而被收集到 定位在该连接管路(2)下方的第二容器(6)中； 连接管路(2)随着定位装置(3)一起转动， 从 而使连接管路(2)的出口定位在第二容器(6)的上方； 优选地， 所述第一驱动装置是蠕动泵(1)； 优选地， 所述第二驱动装置是电机(4)； 优选地， 所述第一阀门是第一两通阀(51)； 优选地， 所述第二阀门是第二两通阀(61)。 2 .根据权利要求1所述的全自动蛋白质纯化系统装置， 其中， 所述层析装置(0)包含液 位探测器(11)。 3 .根据权利要求1或2所述的全自动蛋白质纯化系统装置， 其中， 所述层析装置(0)是层 析柱。 4 .根据权利要求1-3任一项所述的全自动蛋白 质纯化系统装置， 其中 ， 所述连接管路 (2)是软管， 更优选地是硅胶软管。 5 .根据权利要求1-4任一项所述的全自动蛋白 质纯化系统装置， 其中 ， 所述定位装置 (3)是定位柱， 更优选地， 所述定位装置可以360度转动。 6 .根据权利要求1-5任一项所述的全自动蛋白质纯化系统装置， 其中， 所述第二驱动装 置是步进电机。 7 .根据权利要求1-6任一项所述的全自动蛋白质纯化系统装置， 其中， 所述自动蛋白质 纯化系统装置至少包含所述第一容器(5)和所述第二容器(6) ； 优选地， 所述全自动蛋白质 纯化系统装置还包含其它4个容器。 8 .根据权利要求1-7任一项所述的全自动蛋白质纯化系统装置， 其中， 所述全自动蛋白 质纯化系统装置还包括： 第三容器(7)、第四容器(8)、第五容器(9)、第六容器(10)、第三阀 门、第四阀门、第五阀门和第六阀门， 所述第三容器(7)、第四容器(8)、第五容器(9)、第六容 器(10)分别通过第三阀门、第四阀门、第五阀门和第六阀门经由管路与层析装置(0)上部连 接； 优选地， 所述第三阀门是第三两通阀(71)； 优选地， 所述第四阀门是第四两通阀(81)； 优选地， 所述第五阀门是第五两通阀(91)； 优选地， 所述第六阀门是第六两通阀(101)； 优选地， 所述两通阀是两通电磁阀。 9 .根据权利要求1-8任一项所述的全自动蛋白质纯化系统装置， 其中， 所有阀门都是常 闭阀门， 只有上电后才变为开启状态； 优选地， 任一时刻只有一个阀门是开通的， 其他都处 在关闭状态。 10 .根据权利要求1-9任一项所述的全自动蛋白质纯化系统装置在纯化蛋白质中的用途。 2 CN 111574584 A 说 明 书 1/5 页 全自动蛋白质纯化系统装置及其用途 技术领域 [0001] 本发明涉及化学工程和生物学领域， 尤其涉及全自动蛋白质纯化系统装置及其用 于蛋白质的亲和层析等分离纯化的用途。 背景技术 [0002] 蛋白质是科学研究领域的重要研究对象和材料， 也是我们社会生活中的重要工业 产品， 比如治疗糖尿病的胰岛素。不管是科学研究还是工业生产， 蛋白质分离纯化是必不可 少的操作。在基因工程技术很成熟的今天， 蛋白质制备通常是重组基因工程手段构建重组 细胞， 然后人为控制蛋白质的强化表达。重组表达细胞构建操作过程中， 在目标蛋白质序列 的上游或下游添加某个能够被特异性、 可逆吸附的多肽/蛋白质序列， 这能够大大方便目标 蛋白质的富集纯化， 这种被特定介质可逆结合的多肽序列通常叫做标签， 这种蛋白质纯化 方式叫做亲和层析， 这是生物学领域最常见的操作之一。 比较常见的亲和层析纯化标签是 连续6个组氨酸的序列， 标记为His*6。具体的亲和层析操作如下， 首先， 含有His*6标签的目 标蛋白质溶液借助其重力驱动流经螯合镍离子基质， 重复2-3次， 让目标蛋白质与介质充分 结合。其次， 目标蛋白质被特异性吸附之后，用含有低浓度咪唑(通常是10-20mM)的缓冲溶 液清洗杂蛋白质。最后用含有高浓度咪唑的缓冲液洗脱螯合镍离子基质， 得到纯度较高的 目标蛋白质， 通常能够达到80％以上。 [0003] 目前主流的蛋白质亲和层析操作方式都是人工， 其缺点如下： 1)整个过程持续几 个小时到几十个小时， 费时费力。2)每次蛋白质样品液的粘度、 浓度等性质不同使每次流经 基质的速度偏差很大， 导致蛋白质的亲和结合效果不一。 [0004] 发 明 名 称 为“ 一 种 适 宜 重 力 柱 的 蛋 白 质 纯 化 自 动 装 置 ”、申 请 号 为 CN201711448428 .2的中国发明专利申请开发了一种自动化蛋白质纯化装置， 其依靠样品液 的重力作为驱动力。其不足之处是仅仅适用重力层析柱类型， 如果样品液的浓度或粘度过 高， 会导致液体流速过慢或者堵塞， 影响操作效果。另外， 该装置属于半自动装置， 不能实现 蛋白质的挂柱吸附、 洗杂蛋白质和洗脱目标蛋白质的完全自动化操作。 [0005] GE医疗公司的蛋白质纯化系统AKTA可自动化完成蛋白质的吸附、 洗杂和洗脱操 作。该类设备通常由高端精密的流体泵来提供动力， 进样电磁阀和多位选择电磁阀来完成 液体流向操作和多波长紫外检测器来确定操作状态和动作切换。其缺点有以下两点： 第一， 设备非常昂贵， 非自动化的常规纯化型号设备通常价格在40-50万人民币， 能够实现完全自 动蛋白质纯化操作型号的价格会更高。第二点， 流体泵、进样阀、旋转阀等关键零部件都属 于精密仪器， 对样品液品质要求很高， 否则容易堵塞或者漏液。 发明内容 [0006] 为了解决现有技术的不足， 本发明的目的在于提供一种包括步进电机、 两通阀、 蠕 动泵及其控制系统的全自动蛋白质纯化系统装置， 其能够完全自动化地完成蛋白质层析纯 化操作， 设备结构简单， 成本低廉， 对样品液品质要求低， 不会出现管路堵塞等问题， 适用性 3 CN 111574584 A 说 明 书 2/5 页 广， 可大大提高生物领域蛋白质层析纯化的自动化和降低人工投入。 [0007] 为实现上述目的， 本发明提供了一种全自动蛋白质纯化系统装置， 其包括层析装 置0、第一驱动装置、 连接管路2、定位装置3、第二驱动装置、第一容器5、第二容器6、第一阀 门、第二阀门及其控制装置， 连接管路2一端连接于层析装置0，另一端连接于定位装置3 上， 第二驱动装置驱动定位装置3， 第一容器5通过第一两通阀经由管路与层析装置0上部连 接， 第二容器6通过第二两通阀经由管路与层析装置0上部连接， 其特征在于， 所述第一驱动 装置驱动第一容器5中的溶液流经层析装置0， 流穿的液体通过连接管路2而被收集到定位 在该连接管路2下方的第二容器6中； 连接管路2随着定位装置3一起转动， 从而使连接管路2 的出口定位在第二容器6的上方； [0008] 在本发明的一个方案中， 所述第一驱动装置是蠕动泵1； [0009] 在本发明的一个方案中， 所述第二驱动装置是电机4； [0010] 在本发明的一个方案中， 所述第一阀门是第一两通阀51； [0011] 在本发明的一个方案中， 所述第二阀门是第二两通阀61。 [0012] 在本发明的一个方案中， 所述层析装置0包含液位探测器11。 [0013] 在本发明的一个方案中， 所述层析装置0是层析柱。 [0014] 在本发明的一个方案中， 所述连接管路2是软管， 更优选地是硅胶软管。 [0015] 在本发明的一个方案中， 所述定位装置3是定位柱， 更优选地， 所述定位装置可以 360 度转动。 [0016] 在本发明的一个方案中， 所述电机4是步进电机。 [0017] 在本发明的一个方案中， 所述自动蛋白质纯化系统装置至少包含所述第一容器5 和所述第二容器6； 优选地， 所述全自动蛋白质纯化系统装置还包含其它4个容器， 即所述自 动蛋白质纯化系统装置包含容器的数目为6个。 [0018] 在本发明的一个方案中， 所述全自动蛋白质纯化系统装置还包括： 第三容器7、第 四容器8、第五容器9、第六容器10、第三阀门、第四阀门、第五阀门和第六阀门， 所述第三容 器7、第四容器8、第五容器9、第六容器10分别通过第三阀门、第四阀门、第五阀门和第六阀 门经由管路与层析装置0上部连接； [0019] 优选地， 所述第三阀门是第三两通阀71； [0020] 优选地， 所述第四阀门是第四两通阀81； [0021] 优选地， 所述第五阀门是第五两通阀91； [0022] 优选地， 所述第六阀门是第六两通阀101； [0023] 优选地， 所述两通阀是两通电磁阀。 [0024] 在本发明的一个方案中， 所有阀门都是常闭两通阀， 只有上电后才变为开启状态； 优选地， 任一时刻只有一个阀门是开通的， 其他都处在关闭状态。 [0025] 在本发明的一个方案中， 所述全自动蛋白质纯化系统装置用于纯化蛋白质， 可以 全自动化完成蛋白质的吸附、 洗涤和洗脱。 [0026] 在本发明的一个方案中， 使用时根据用户的具体需求再增加对应的层析柱。 [0027] 本发明的有益效果包括： [0028] (1)本发明设备能够对蛋白质样品实现完全自动化的层析纯化操作。 [0029] (2)本发明采用2个或2个以上的容器， 装样品液和清洗液， 不同样品液之间的选择 4 CN 111574584 A 说 明 书 3/5 页 通过阀门(例如电磁阀)等on/off之类流体控制阀即可简单实现。 [0030] (3)经过层析柱之后的液体去向的选择仅由1个驱动装置(例如步进电机)转动即 可简单实现。 [0031] (4)液位探测及其延迟时间的设计， 方便指示在不同液体中切换操作， 确保层析介 质不流干。 [0032] (5)液体驱动力由蠕动泵驱动， 简单可靠， 且对样品液品质要求低， 增加设备的适 用范围。 附图说明 [0033] 图1为本发明的全自动蛋白质纯化系统装置。 图2示出本发明全自动蛋白质纯化系统装置， 硅胶软管2定位在第二容器6的正上方。 [0034] 附图标记说明： [0035] 0、 层析柱； 1、 蠕动泵； 2、硅胶软管； 3、定位柱； 4、步进电机； 5、第一容器； 6、第二容 器； 7、第三容器； 8、第四容器； 9、第五容器； 10、第六容器； 51、第一两通电磁阀；61、第二两 通电磁阀； 71、第三两通电磁阀； 81、第四两通电磁阀； 91、第五两通电磁阀；101、第六两通 电磁阀； 11、 液位探测器 具体实施方式 [0036] 以下结合具体实施例， 进一步阐明本发明， 本实施例在以本发明技术方案为前提 下进行实施， 应理解这些实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围。 [0037] 实施例1全自动蛋白质纯化系统装置 [0038] 图1显示了全自动蛋白质纯化系统装置。 所述全自动蛋白质纯化系统装置包括层 析柱0、 蠕动泵1、硅胶软管2、定位柱3、 步进电机4、第一容器5、第二容器6、第三容器7、第四 容器8、第五容器9、第六容器10、第一两通电磁阀51、第二两通电磁阀61、第三两通电磁阀 71、第四两通电磁阀81、第五两通电磁阀91、第六两二通电磁阀101、 液位探测器11及其电路 板控制系统， 其中， 步进电机4驱动与之相连的定位柱3， 使定位柱可以360度转动； 硅胶软管 2的一端连接层析柱0的出口， 中间卡在蠕动泵上， 另外一端固定在定位柱的横杆上。根据设 定指令， 硅胶软管2随着定位柱3一起转动， 从而使硅胶软管2的出口可以定位在第一容器5、 第二容器6、第三容器7、第四容器8、第五容器9或第六容器10中的任一容器的上方(图1示出 定位在第三容器7的上方)。 [0039] 层析柱0分为上部和下部， 其中， 层析柱0的上部通过管路与容器连通， 层析柱0的 下部(网格部分)填充有亲和介质。第一容器5、第二容器6、第三容器7、第四容器8、第五容器 9和第六容器10底部均有出口连接管路， 该连接管路分别相应地先与第一两通电磁阀 51、 第二两通电磁阀61、第三两通电磁阀71、第四两通电磁阀81、第五两通电磁阀91或第六两通 电磁阀101连接， 之后再通过管路连接到层析柱0的上部接口。所有电磁阀都是常闭电磁阀， 只有上电后才变为开启状态。根据操作程序的预设指令， 任一时刻只有一个电磁阀是开通 的， 其他都处在关闭状态。层析柱0下部出口与硅胶软管2连接， 硅胶软管由蠕动泵 1控制并 提供动力。根据预设指令进行运转， 第一容器5、第二容器6、第三容器7、第四容器8、第五容 器9和第六容器10中某个电磁阀开启， 蠕动泵驱动与之对应的容器中的溶液流经层析柱0， 5 CN 111574584 A 说 明 书 4/5 页 流穿的液体通过硅胶软管2而被收集到定位在该硅胶软管2正下方的某个容器中。 [0040] 在层析柱0内部的上方的一定高度位置处设置一个液位探测器11， 用于利用溶液 的导电性来提醒液体液位情况。液体正常流动时， 液位探测器上面的A/B金属探头(图1中11 下部“+”“ , -”所示)都浸没在样品液中， 由于液体的导电性， 探测器会给出高电平信号， 表示 当前溶液正常流动。 当样品即将流干了， 层析中的液位慢慢下降， 某时刻促使探测器裸露在 液面之上， 探头上2个电极断开连接， 会给系统一个低电平信号， 表明当前液体即将流干， 提 醒程序即将可以进入下一阶段。 [0041] 实施例2控制参数设计 [0042] 本发明设备主要可设定的运行参数有3个： 挂柱次数N、 延迟时间T秒和液体流速。N 代表样品液流经层析柱的次数， 实际上就是样品与介质的吸附次数， 在人工进行蛋白质层 析纯化时， 通常挂柱吸附2次就足够了， 故可以直接设定N等于2。延迟时间T秒是指在设备运 转时， 液位探测器的A/B金属探头上的电极刚露出液面时， 系统会收到从高电平切换到低电 平的信号， 实际还需要T秒之后， 图1中层析柱0内部的液面才能降低到吸附介质的上端位置 (表明样品被消耗完) ， 此时再进入下一步操作， 比如切换电磁阀。时间T的设置需要根据设 备的具体参数来设定， 具体与液体流速、层析柱的内径和液位探测器高/低位置相关。延迟 时间T设定值， 通过实测实验结果来确定。液体流速以每分钟多少毫升流量来表示， 与蠕动 泵的转速和对应软管2尺寸相关， 具体看使用者需求来设定， 也是通过实测实验结果来确 定。 [0043] 实施例3蛋白质亲和吸附 [0044] 带His*6亲和纯化标签蛋白质的大肠杆菌细胞超声波破碎后， 经过16000g离心力 高速离心30分钟得到的上清液， 得50毫升体积的上清液， 将该上清液放置在图2中的第一容 器5 中。挂柱次数N设定为2， 流速设定为1 .5毫升/分钟， 延迟时间T等于30秒。装有镍介质的 层析柱提前用50mM Tris蛋白质缓冲液(pH＝8)平衡好。选择“吸附”模式并启动自动程序 后， 第一容器5连接的第一两通电磁阀51上电后连通管路， 硅胶软管2定位在第二容器6的正 上方。蠕动泵启动， 驱动第一容器5的新鲜蛋白质液体源源不断通过电磁阀51之后， 流经含 有亲和介质的层析柱0， 吸附后的流穿液体通过硅胶软管2被收集到第二容器6中。整个吸附 过程中液位探测器11一直处在高电平状态。约29分钟时， 样品液将要消耗完， 液位探测器切 换到低电平， 再延迟30秒后， 系统关闭第一两通电磁阀51并同时开启第二两通电磁阀61， 然 后转动定位柱， 使固定在定位柱上的硅胶软管2定位到第一容器5的正上方，用于下一步收 集第二次挂柱吸附之后的样品液。之后开始蛋白质样品液的第二次吸附挂柱， 第二两通电 磁阀61开启后的几秒钟内， 液位探测器再次浸没在样品液中， 系统变成高电平。大概 30分 钟后， 直到液位探测器再次裸露液面， 由高电平转换为低电平， 此时蛋白质样品的第二次吸 附操作完成， 关闭所有电磁阀和蠕动泵。整个过程完全自动化， 无需人工干预。 [0045] 实施例4蛋白质亲和吸附、 洗杂和洗脱 [0046] 蛋白质样品的挂柱吸附操作与实施例2完全相同(挂柱次数N设定为2， 流速设定为 1 .5 毫升/分钟， 延迟时间T等于30秒) ， 选定“纯化”模式。挂柱2次后， 系统会先用放置在第 三容器7中的100毫升洗杂缓冲液(50mM Tris缓冲液， 20mM咪唑， pH＝8)洗掉非特异性吸附 的杂蛋白质， 再用放置在第四容器8中的50毫升洗脱缓冲液(50mM Tris缓冲液， 300mM 咪 唑， pH＝8)洗脱目标蛋白质， 其他设置同实施例1。 6 CN 111574584 A 说 明 [0047] 书 5/5 页 系统即将完成第二次吸附挂柱时(见实施例2) ， 液位探测器由高电平切换到低电 平之后 30秒， 系统关闭第二两通电磁阀61， 同时开启第三两通电磁阀71， 并由步进电机4驱 动硅胶软管2， 使其定位到第六容器10的正上方，用于收集洗涤层析柱的废液。开始进行洗 涤层析柱上面杂蛋白质的自动化操作， 第三容器7中的洗杂缓冲液通过第三两电磁阀71之 后， 流经含有亲和介质的层析柱0， 洗涤后的流穿液体通过硅胶软管2被收集到第六容器10 中。整个洗涤运行过程中， 液位探测器一直浸没在液体中， 处于高电平状态。约66分钟后， 液 位探测器变成低电平之后30秒， 系统完成了层析柱的洗涤杂蛋白质操作。 [0048] 系统关闭第三两通电磁阀71， 同时开启第四两通电磁阀81， 并由步进电机4驱动硅 胶软管2， 使其定位在第五容器9的正上方， 用于收集目标蛋白质。开始持续约30分钟的洗脱 目标蛋白质操作， 第四容器8中的洗脱缓冲液通过第四两电磁阀81之后， 流经含有亲和介质 的层析柱0， 洗脱后的流穿液体通过硅胶软管2被收集到第五容器9中， 得到洗脱的蛋白质样 品液。整个洗脱运行过程中， 当液位探测器再次由高电平变为低电平之后30秒， 系统关闭蠕 动泵和所有电磁阀。 [0049] 经过上述步骤， 系统全自动化完成了目标蛋白质的吸附、 洗涤和洗脱的所有操作。 7 CN 111574584 A 说 明 书 图1 8 附 图 1/2 页 CN 111574584 A 说 明 书 图2 9 附 图 2/2 页