激光扫描共聚焦及单光子检测技术原理及应用.pdf

From Eye to Insight 激光扫 原理及 共聚焦及单 用 陈敏婕 广州 徕卡显微系统 Application 贸易有限公 公 海 子检测技术 激光扫 共聚焦及单 子检测 技术原理及 用 • 激光扫 共聚焦的构 及原理 • 激光扫 共聚焦的 能及优异性 • 品要求及生物 学中的 用举例 • 荧光相 光谱培C分以及荧光寿命成 培LIM 技术介绍 激光扫 一 共焦显微镜技术及 原理 • 荧光的原理 • 荧光显微镜的成 原理 • 共聚焦的原理， 荧光显微镜的 别 用 荧光的原理 什 是荧光 ? • • 物质中的电子吸收光的能 能状态转 高能状态，再回到 能状态时释放出的光， 是非温度辐射光双双冷光 即：物质吸收短波 光，发射出的长波光 显微镜荧光利用光源激发双双光化荧光 荧光 象 Page 5 荧光原理 高能级、不稳 态 Stokes频移 能级 照明光 (激发光) 低能级、稳态 荧光物质，探针、 染料、蛋白... 荧光 (发射光) 荧光 象 荧光染料 Atto and Tracy (Sigma Aldrich) Alexa Fluor (Invitrogen) BODIPY (Invitrogen) Cy-dyes FluoProbes (Interchim) DyLight Fluor (Thermo Scientific, Pierce) DY and MegaStokes Dyes (Dyomics) Sulfo Cy dyes (CYANDYE, LLC) Emission spectra for the Alexa Fluor dye series life technology Page 8 荧光蛋白 The FP beach Page 9 R.Tsien 2009 Nobel lecture 荧光显微镜的成 的原理 Fluorescence Filter Block 荧光观察： 荧光显微镜是用短波长的光线照射 用荧光素染色过的被检物体，使之 激发后而产生长波长的荧光，然 后观察 荧光镜检术广泛 用于生 物， 学等领域 14 Ju速y 2016 宽场荧光显微镜的局限 Confocal vs C-CCD C-CCD camera 细胞标本 Confocal 11 宽场荧光显微镜的局限 Camera 相机 光镜 激发光源 焦点外信 焦点信 宽场荧光成像 Widefield Drosophila melanogaster (larvae) Green: Nuclei (RNA binding protein), Alexa 488; Red: Axons, Cy 3; Blue: Axon endings (of MJ94-positive neurons), Cy 5 Courtesy: Dr. Christoph Melcher, Research Center Karlsruhe 荧光显微镜成 Specimen Lens X 原理 荧光显微镜成 Specimen Lens X 原理 荧光显微镜成 Specimen Lens X 原理 荧光显微镜成 Specimen Lens X 原理 荧光显微镜成 Specimen Lens X 原理 激光共聚焦成 原理 针孔 Specimen Lens X 激光共聚焦成 原理 针孔 Specimen Lens X 共聚焦显微镜原理 和相对优势 P M T 探测器 针孔 光镜 激发光源 点光源 光学扫 焦点外信 焦点信 器 宽场 vs. 共聚焦荧光成像 Widefield Drosophila melanogaster (larvae) Green: Nuclei (RNA binding protein), Alexa 488; Red: Axons, Cy 3; Blue: Axon endings (of MJ94-positive neurons), Cy 5 Courtesy: Dr. Christoph Melcher, Research Center Karlsruhe Confocal 单光 共聚焦 vs 宽场显微镜 WHAT IS CONFOCAL MICROSCOPY WIDEFIELD MICROSCOPE CONFOCAL MICROSCOPE WHAT IS CONFOCAL MICROSCOPY Optical Sectioning Localization of critical position in 3D structure Confocal effect 对实验对象 进行 显微CT 荧光分光部件 宽场荧光显微镜 --滤色片 光 激光扫描共聚焦 --光谱 光 染料发射光谱参数 光谱，任意范围 滤色片范围 共聚焦显微镜 显微镜 系统显示器 扫描头 激光+控制单元 镜 控制单元 计算机工作站 31 扫 显微镜 显示器 X Z Y 标本 OLYMPUS 32 WHAT IS CONFOCAL MICROSCOPY Principle of CLSM Scanning Microscope X Z Y 激光扫 共聚焦及单 子检测 技术原理及 用 • 激光扫 共聚焦的构 及原理 • 激光扫 共聚焦的 能及优异性 • 品要求及生物 学中的 用举例 • 荧光相 光谱培C分以及荧光寿命成 培LIM 技术介绍 荧光显微镜和激光扫 共聚焦的 • 共聚焦的优点 – 光学 片 双双单层 维成 – 高 差图 – 同步多通道荧光和光谱 – 不OOM放大 双双充 –定 发挥物镜 趣 双双ROI 辨率 域扫 速ine – 光操作 双双分IM或AO切培 旋转等 能 别 共聚焦显微镜已经被广泛应用于 生物荧光相关研究 —— 胞成像 对于一般的厚组 片成像( 20~ 50um) 共聚焦也具有明显优势 维重建和 割 XZ XY YZ XYZ重建和测量—— 唯一能做 维测量共聚焦成像软件 长时间活细胞成像 Time Lapse 激光扫 共聚焦及单 子检测 技术原理及 用 • 激光扫 共聚焦的构 及原理 • 激光扫 共聚焦的 能及优异性 • 品要求及生物 学中的 用举例 • 荧光相 光谱培C分以及荧光寿命成 培LIM 技术介绍 荧光探针的选择 据实验目的确定需要检测指标 确定可供选择的荧光探针的范围 荧光探针是否符合荧光 品的 特性 品的制备要求 探针的灵敏度及荧光强度 标记后的光谱特性和 稳定性 荧光探针 共聚焦系统的 实验中存在的 品自身 扰 配 扰情况 品制备过程的 扰 仪器条件 境因素等 实验器皿的选择 选用 专用 薄，均一，无荧光吸收的Confoca速 养皿 (1)NUNC Inc Lab-tak coversi速ips cha造bers 8-we速速(cat.no 136439) (2) Mat切ek corporation g速ass botto造 造icrowe速速 dishes 改良的Petri 养皿特殊 光学盖玻片贴于孔 Confocal专用培养多孔板 Lab-切ek™ Cha造ber 分速ide™ Products Confocal专用培养皿/多孔板 激光扫 共焦显微镜 用 能. 1.多荧光标记 品的高清晰度 高 辨率图 采集 2.无损伤 连续光学 片，显微 C切 3.真正的 维重组 4. 维叠 图 维共定 的显示 5.可沿不轴 xy 面 和Y轴 xz 面 方向进行光 6.定 析 7.时间序列扫 : xyt xyzt 和 xt 扫 8.图 处理 9.旋转扫 10.感 趣 域扫 11.光谱扫 多通道 维重建 Multicolor image of a Zebrafish embryo. Lateral line primordium labeled with GFP (Green), neurons with DsRed (red), nucleus with BFP (blue). SHG signal from muscles (grey). Courtesy of Dr. Lionel Newton, EMBL Heidelberg , Germany. 从测 到 维 析 2D Analysis extensions - background subtraction - thresholding methods - call ImageJ macros 2D tracking 3D multi channel analysis 48 共聚焦：显微CT 49 Lei受a TCS SP8 四维成 . Zebrafish Development for 17 hours Expression of cytoplasmic GFP in the notochord and prechordal plate, 980nm. Nuclei stain through RNA injection H2B-mCherry @1030 nm. Courtesy of BioEmergences USR3695 (IBiSA FBI), Gif sur Yvettes, France. 徕卡SP8 - 最快扫描速度 同一系统内实现高分辨率扫描(全视野扫描)+ 高速扫描(共振扫描) 扫描器 最高扫描分辨率 扫描速度 @ 512×512 全视野扫描器 8192×8192 7 fps 共振扫描器8k 1024×1024 28 fps 共振扫描器12k 832×832 40 fps 组 液 胞流动 血管内血 胞流动 XY切动态成 伊乐藻Timelapse 3ch Elodea 29fps.avi 54 活细胞成 系统 延时摄影Time Lapse：实时或延时通过显微镜观察及记录细胞内部结构 和细胞生理过程 细胞在显微镜 一边 养一边观察记录 采用荧光和号IC/相差 自动对焦 自动成 This image cannot currently be display ed. 小鼠胚胎异染色质的形成需要关键的组蛋白 体H3.3. Courtesy of ME Torres-Padilla (Team L. Tora) & Marc Koch (Imaging Centre IGBMC). 显微注射oregon green后细胞的生存实验 Courtesy of Adrien Eberlin (Team L Tora) & Marc Koch (Imaging Centre IGBMC). 56 长时间XY切动态成 In vivo imaging – C.elegans First installed TCS CARS in Graz / Austria Courtesy of Prof. Sepp D. Kohlwein and Heimo Wolinski, University of Graz, Austria CARS is an excellent technique to image living animals 大视野的好处 - 自动拼图 大视野拼图，高倍拼图成大视野，小鼠的鼻腔层断面 59 钙离子成 养/ 离的细胞 → 20µM Fluo 3-AM负载液30-60min → 清洗 换液 → 扫 KCL诱导的细胞外Ca++内流测 须快 测 KCL KCL 快 成 需要：快 期待已久的定 感 趣 &钙离子成 析和比例成 域可以从2D图 析界面复制/粘贴 到定 析界面 61 激光扫 共聚焦及单 子检测 技术原理及 用 • 激光扫 共聚焦的构 及原理 • 激光扫 共聚焦的 能及优异性 • 品要求及生物 学中的 用举例 • 荧光相 光谱培C分以及荧光寿命成 培LIM技术 介绍 化生命! – 面临的挑战 浓度? 解释 子运动? 预测模型! 子相互作用? 扩散行 ? 象! 验证设想! 优化试剂! 子鉴别? 改进流程! 动力学? 信 验证数据! 转导? 易 ? Possibilities: FCS - FCCS - FLIM – FRET - FLCS - gated FCS 理解生命 象! 定量测量 TCS SMD系列 —— 研究 命动态的平 SMD specific components TCS SP8 1 FCS单光 TCS SMD子探测器 系列: 生物物理提供最大灵活性 2 单光子 计数器 3 XZY纵向 扫 4 FCS 析软件 SMD 特别组件 TCS SP8 系统集成，统一调控 共聚焦和SMD部件全面整合 用户只需控制LAS X 数据处理简单 靠 X 专用的实验向导 预设条件，快速获 结果 什 是 FCS? FCS: 建立在荧光 象 础 的测 方法 它能够测 和 析单个 子进入和离开一个特定的很小 的观察体积动态过程 这个观测体积一般 共聚焦成 的焦点(约0.15fl). 对 子的运动引起 的荧光强度 化的 析提供个研究者附 的信息 FCS 读出参数和提供的信息： • 子的 均数 • 扩散时间 • Fraction of components • 线态或其他的荧光 子暗态 => 浓度 => 子大小, 境 度 => 结合-自 比 => 化学 的动力学参数 => 衡参数 => 子自身特性 => 境参数 (pH, …) 观测体积 FCS来源 历 • 荧光相关光谱(FCS)是一种新兴的单 子检测技术 它的 概念最早是于1972 由Magde Elson和Webb等在涨落 光谱的基础 共同 出来 它通过测定由于粒子进出微 小的检测体积而造成的荧光信号的涨落来获取粒子的 动态参数，如浓度和扩散系数等 荧光相关光谱开始被 应用于生物体系中稀浓度 的生物大 子的化学动力 学研究 FCS – 工作流程 • 激光束被固定在一个要被测 的 点 测 体积 荧光粒子进入和离开测 I(t) • 记录荧光信 的 体积 动 t • 计算相 函数 • 对相 函数进行拟和 => 得到 同的参数(N, τ, α, …) G(τ) log τ autocorrelation curve. Timescales of various processes monitored by autocorrelation analysis FCS典型应用 浓度测量 扩散和不规则扩散 相 转 o 磷脂 层 聚化 o 脂类或跨膜蛋白聚集 构象改 o DNA解链/ 化 结合 应 (体内和体外) o 配体- 体相互作用 o 蛋白质-DNA相互作用 o 酶动力学 o 蛋白质-蛋白质相互作用 FCS measurement in HeLa 受ell, C可urtesy 可f Matthias Weiss an变 Je变rzej Szymanski, DKFZ FCS向导: 步完成设置 第 1 步: 使用正常成 模式找到想要 观测的 本， 拍摄一幅图 或图 组 (xy z 或 xz y). 第 2 步: 优化 FCS 测 条件 第 3 步: 定 FCS 测 点或系列 (xy z 或 xz y + t). 开始数据采集 点击Strat后，出 图： 如果拟合曲后residuals trace如 图， 没有明显趋势， 很均匀的，则比 较好，说明测量结果比较 信，接近 真实 如果拟合曲后residuals trace如 图，有 明显趋势， 均匀，则此次测量结 果 信，说明当前的拟合模型如 Pure Diffusion等 能充 述这种样本 的相关性了，需考虑换模型 拟合模型 显示拟合模型的公式 Veff：有效容积，需要每 校准，一般为0.2-0.4fl飞升 Z0 um ：有效容积的高半径 W0 um ：有效容积横截面的半径 ρ1：样品 子的当前振幅 τ1 ms ：扩散时间 荧光 子 均在有效容积内的停留时间 D1 um2/s ：扩散系数 N： 子数量 有效容积内的 C nM ：浓度 纳摩 κ=z0/w0，κ偏心距/偏心率 τ1 ：Diffusion time of the 1 th diffusing species. 点开每一项，如果+-值 大的，则 信 用实例：活细胞中的 EYFP 测 (1) HeLa cells expressing pure EYFP which is expected to be freely mobile (Cells courtesy T. A. Knoch, K. Rippe, German Cancer Research Center and KIP, University of Heidelberg) FCS measurement spot 用实例：活细胞中的 EYFP 测 (2) Diffusion in the nucleus 0.0 sec 0.1 sec 0.2 sec 0.3 sec 0.4 sec Molecules start at red spot: Covered area after x seconds 用实例：活细胞中的 EYFP 测 meas. 0.025 0.02 0.015 0.01 0.005 1.00E-06 1.00E-05 1.00E-04 1.00E-03 1.00E-02 la g time [se c] 0 1.00E-01 1.00E+00 autocorrelation function fit (3) 测 结果: HeLa 细胞 中自 移动的 EYFP 的自相 函数: • 测 点内含有 ~45 个 子, 在 大约0.15 fl 的测 体积内， 子浓度约 ~60 nM • 扩散时间约 ~500 µsec, i.e., 扩散系数 ~30 µm2/sec, i.e., 性比水高 倍 活细胞FCS 乳腺癌细胞MCF-7，标记的是脂筏，染料是 Alexa-488 labeled cholera toxin B subunit, *测得结果： 扩散系数：0.86um2/s 扩散时间：9.55ms 子数： 34 当前浓度：280nM/ml 有效容积：0.2fl 通 道 以罗丹明B 异硫氰酸酯标记的人Ig基 量子 点的标记羊抗人Ig基 的免疫反应为模型体系 *罗丹明B *量子点 活细胞FCCS FLIM (FLUORESCENCE LIFETIME IMAGING MICROSCOPY) 荧光寿命成 显微镜 什 是培LIM? Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy – FLIM - 普通共聚焦亮度成 建立在荧光 础 的显微技术 析荧光 子在激发态的寿命 通过和成 信息的结合 析 ⇒ 荧光寿命的空间 布信息 ⇒ 获得附 信息 子识别，微 荧光寿命成 /ps 境， 子结合 p~ãéäÉW=mêáçåáìãI= ëí~áåÉÇ=ïáíÜ=p~Ñê~åáå= ~åÇ=c~ëí=ÖêÉÉå FLIM – 工作流程 Time/ns 在 个 素重复测 激光脉冲 发出和探头收到荧光光子之间 的时间 获得光子数 对到达时间的 布图 对 个 布图进行指数衰 拟 和. τ 即 所得荧光寿命 使用伪色显示寿命图 FLIM 向导： 第1 步: 使用正常成 步完成设置 模式找到 本 第2 步: 优化 FLIM 测 条件 第 3 步: 设定 FLIM 数据采集条件， 开始采集 FLIM实验向导：新的应用 FLIM时间序列 FLIM xyz FLIM xzy FLIM xyλ发射光谱扫描 (SP FLIM) FLIM xyλ激发光谱扫描 (WLL FLIM) FLIM层 +时间序列 ABC (aut可mate变 取rightness 受可ntr可l，自动亮度控制) 在向导中定 FLIM xz y-系列 典型 FLIM 无需染色 本 用 自发荧光 : 测定代谢状态 癌症研究：识别转化的细胞 植物生理：病原宿 形态学：识别 壳素和木质素结构 FLIM image of scale insect antenna (nonstained): Image was reconstructed from a 3dimensional FLIM-z-stack, using Amira SW Courtesy of Kees Jalink 典型 FLIM 染色 本: 用 图 信息增 一个新的维度 能 转移(FRET)用以测 子结合和 子间距离 局部离子浓度 (Ca2+, Na+, pH), 配体, 氧含 微 境研究 (粘滞度， 折射系数，胞膜电 染料 离 染料的光物理特性 Conventional confocal intensity image Fluorescence lifetime image of cells expressing CFP-YFP Courtesy: G. Hams, University of Würzburg FLIM层 ：形态学研究 3-变imensi可nal FLIM sta受k 可f lily 台可llen grain, t可tal sta受k size in z: 37 µm Image 1 Image 7 Image 13 Image 19 Image 22 Image 25 Image 31 Image 37 Image 43 Image 47 3D寿命图像 1.2 ns P可llen grain fr可m lily, 3 变imensi可nal ren变ering an变 re受可nstru受ti可n fr可m FLIM image v可lume sta受k, 变可ne with Amira s可ftware 0.5 ns Leica网 课程 • Leica Science Lab网址： • www.leica-microsystems.com/science-lab/ www.leica-microsystems.com/science-lab X Than 92