NMR對樣品製備要求v2.pdf
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NMR 對樣品製備要求 1. 溶劑應大於 0.5 mL，若溶劑量少，掃描速率會變慢，得到峰形不佳 2. 樣本不應有固體微粒或沉澱，應先過濾去除 3. 樣本濃度要求：H 譜 10 mg/0.5 mL；C 譜 >10 /0.5 mL 且濃度越大越好 4. 樣本中不應含任何磁性物質 5. 樣本管應平直，粗細均勻，不能有任何金屬存在，亦不能⽤金屬捆綁固定；儘量不 要貼標籤紙，以免影響樣本管在磁圈內旋轉；樣本管必須使⽤專屬的管帽，並蓋緊 以防泄漏或揮發，可使⽤封口膜再密封 6. 重覆利⽤的樣本管清洗後可使⽤氮氣吹乾，烘乾時溫度不超過 100℃ 7. 實驗室室溫過高時，可能會影響磁場穩定性，建議暫停實驗 8. (1) D-solvent 是⽤來鎖定磁場，FT-NMR ⼀定得使⽤ D-溶劑 (2) D-solvent 是⽤來去除背景。 9. ⼀般測 1H 譜時，溶劑不能⽤含 1H 成分之溶劑(需 <1 %)。 否則 1H 譜將僅只能見到又大又寬之溶劑峰，這時就需要做溶劑抑制實驗(solvent suppression) NMR 能做什麼？ NMR（核磁共振波譜法）是研究原子核對射頻輻射的吸收，是對各種有機和無機物的成分、結構 進行定性分析的最強有力的工具之一，有時亦可進行定量分析。核磁共振是有機化合物結構鑒定 的一個重要手段,一般根據化學位移鑒定基團；由偶合分裂峰數、偶合常數確定基團聯結關係；根 據各 H 峰積分面積定出各基團質子比。核磁共振譜可用於化學動力學方面的研究，如分子內旋 轉，化學交換等。核磁共振還用於研究聚合反應機理和高聚物序列結構。二維核磁共振譜已經可 以解析分子量較小的蛋白質分子的空間結構。核磁共振譜是有機化學家們心目中的“四大名譜”之 一（包括：紫外光譜、紅外光譜和質譜）。H 譜、C 譜是應用量廣泛的核磁共振譜，較常用的還 有 F、P、N 等核磁共振譜。 怎麼解析核磁共振氫譜？ 一般先確定孤立甲基及類型，以孤立甲基峰面積的積分高度，計算出氫分佈；其次是解析低場共 振吸收峰（如醛基氫、羰基氫等），因這些氫易辨認，根據化學位移，確定歸屬；最後解析譜圖 上的高級偶合部分，根據偶合常數、峰分裂情況及峰型推測取代位置、結構異構、立體異構等二 級結構資訊。 怎麼解析核磁共振碳譜？ 一般先查看全去偶碳譜上譜線數與分子式中所含碳數是否相同？數目相同說明每個碳的化學環境 都不同，分子無對稱性；數目不相同（少）說明有碳的化學環境相同，分子有對稱性；然後由偏 共振譜，確定與碳偶合的氫數；最後由各碳的化學位移，確定碳的歸屬。 怎麼結合應用碳譜和氫譜？ C 譜和 H 譜可互相補充。H 譜不能測定不含氫的官能團，如羰基和氰基等；對於含碳較多的有機 物，如甾體化合物，常因烷氫的化學環境相似，而無法區別，這是氫譜的弱點；而碳譜彌補了氫 譜的不足，它能給出各種含碳官能團的資訊，幾乎可分辨每一個碳核，能給出豐富的碳骨架資 訊。但是普通碳譜的峰高常不與碳數成正比是其缺點，而氫譜峰面積的積分高度與氫數成正比， 因此二者可互為補充。 元素週期表中所有元素都可以測出核磁共振譜嗎？ 不是。首先，被測的原子核的自旋量子數要不為零；其次，自旋量子數最好為 1/2（自旋量子數 大於 1 的原子核有電四極矩，峰很複雜）；第三，被測的元素（或其同位素）的自然豐度比較高 （自然豐度低，靈敏度太低，測不出信號）。 怎麼在 H 譜中更好的顯示活潑氫？ 與 O、S、N 相連的氫是活潑氫，想要看到活潑氫一定選擇氘代氯仿或 DMSO 做溶劑。在 DMSO 中 活潑氫的出峰位置要比 CDCl3 中偏低場些。活潑氫由於受氫鍵、濃度、溫度等因素的影響，化學 位移值會在一定範圍內變化，有時分子內的氫鍵的作用會使峰型變得尖銳。 怎麼做重水交換？ 為了確定活潑氫，要做重水交換。方法是：測完樣品的氫譜後，向樣品管中滴幾滴重水（不宜加 入過多，一般 1-2 滴即可），振搖一下，再測氫譜，譜中的活潑氫就消失了。醛氫和醯胺類的氨 基氫交換得很慢，需要長時間放置再測譜或者用電吹風加熱一下，放置一會再進行檢測。此時會 發現譜圖中水峰信號增強，在 CDCl3 中此時的 HDO 峰會在 4.8ppm 的位置。此外，甲醇和三氟醋 酸都有重水交換作用，看不到活潑氫的峰。 解析合成化合物的譜、植物中提取化合物的譜和未知化合物的譜，思路有什麼不同？ 合成化合物的結果是已知的，只要用譜和結構對照就可以知道化合物和預定的結構是否一致。對 於植物中提取化合物的譜，首先應看是哪一類化合物，然後用已知的文獻資料對照，看是否為已 知物，如果文獻中沒有這個資料則繼續測 DEPT 譜和二維譜，推出結構。對於一個全未知的化合 物，除測核磁共振外，還要結合質譜、紅外、紫外和元素分析，一步步推測結構。 NMR 常用內標物 氫譜：非水溶劑四甲基矽烷（TMS）水溶液為 2,2-二甲基戊矽烷-5-磺酸鈉(ＤＳＳ) 碳譜：四甲基矽烷（ＴＭＳ）或者氘代試劑中的碳峰 TMS 優點： TMS 分子中 12 個 1H 處於完全相同的化學環境，只產生一個尖峰，少量的 TMS 即可測出 NMR 信號；遮罩強烈，共振吸收峰位於譜圖最右端。與有機化合物中的 1H 峰不重疊；化 學惰性；易溶於有機溶劑；沸點低（27℃），樣品易回收。 硼譜：乙醚三氟化硼或者三甲氧基硼 磷譜：８５％磷酸（但只能作為外標） 鋰譜：４Ｍ高氯酸鋰溶液 鈉譜：1M 氯化鈉溶液 矽譜：四甲基矽烷，但在低頻區則用四乙基正矽酸酯 NMR 常用同位素核有關物理參數 a 磁旋比的單位是 107 弧度/特斯拉/秒 b 共振頻率以 1H 頻率為 100MHz 作參考 c 檢測靈敏度以 1H 為 1 作為參考，並考慮了同位素的天然豐度。 請大家記住：無論內標還是外標，實際化學位移值隨溫度變化而變化，而標準物本身就受 溫度的影響。如溫度每改變 30K，TMS 質子共振信號將變化 0.1 ppm。因此，如果做變溫 試驗，最好標明詳細的實驗過程。 NMR 所需樣品量 在核磁共振實驗中，樣品的量控制也是一門學問，有的產品是多步合成的，很寶貴，例如 全合成產品。對於氫譜，3 到 10 毫克樣品足夠。對於分子量較大的樣品，有時需要濃度更 大的溶液。但濃度太大會因飽和或者粘度增加而降低解析度。對於碳譜和雜核，樣品濃度 至少為氫譜的 5 倍（一般在 20-500 毫克左右）。 對於二維實驗，為了獲得較好的信噪比，樣品濃度必須夠。根據經驗，25 毫克樣品足以完 成所有實驗，包括氫碳相關 HMBC 實驗。如果樣品只有 1 到 5 毫克，只能完成均核氫氫 相關實驗，是與碳相關的實驗至少需要過夜。保持樣品高度或者體積一致。這將減少換樣 品後的勻場時間。對於 5 毫米核磁管，樣品體積應為 0.6 毫升或者樣品高度為 4 釐米。 樣品和樣品管 樣品：純淨，乾燥，溶液內無灰塵或沉澱，尤其不應含有鐵磁性雜質。特殊條件下需要過 濾或除氧。黏度不要過高（影響馳豫時間），黏度越大，解析度越差，樣品可適度稀釋來 提高解析度。 溶液內的灰塵會使譜線明顯變寬而降低解析度，再好的勻場也無法解決該問題。 樣品管：勻質，清潔，不攜帶鐵磁性物質。不要用洗液洗滌，以免帶入很難除去的順磁雜 質。不要在溫度太高的烘箱裡直立烘太久。 樣品管的直徑： 5mm 最常用 3mm 用於樣品量很少的樣品 10mm 用於觀測低靈敏度核或溶解度受限制的樣品 溶液體積： 5mm probe 0.4-0.6ml 3mm probe 0.1-0.15 ml 樣品管處於合適的高度，使樣品處於磁場的最強且最均勻的部分。 足夠的溶液高度，3.5～5cm。 對於 5 毫米核磁管，樣品體積應為 0.5 毫升或者樣品高度為 4～4.5 釐米。太低的溶液高 度使勻場所需時間大大增加，而且很難得到高品質的譜圖。不要為了增加濃度而過分縮小 溶液的體積。 譜儀的磁場強度越高，儀器靈敏度也高，對於污染物、樣品製備不好和不好的樣品管的靈 敏度也增加。 選擇合適的氘代溶劑 o 譜議靠氘信號鎖場和勻場，一般要求：惰性，低沸點，價格儘量便宜首要規則，氘代原子 越多，價格越高。 o 溶解度：越大越好，以增加實驗的靈敏度。 o 溶劑信號對樣品的干擾：越小越好，儘量不與譜峰範圍重疊。 o 溫度可靠性：在實驗溫度下不會揮發或凝固，溶解度不會受太大影響。比如，D6-DMSO 凝固點 18.4 度,如果實驗室不是恒溫的,冬天凝固很正常溫度低會發生凝固。 o 粘滯性：粘滯性越小，解析度越好 o 水含量：幾乎所有核磁溶劑裡都有痕量或更多的水，水的存在會降低譜圖的品質。 o 帶活潑氫的試樣儘量選擇不含活潑氫的試劑，避免該峰因氫氘交換而無 法在圖譜中表現出 來 o 適當的芳香氘代溶劑有可能簡化圖譜 首選溶劑：CDCl3，尖銳的單峰，7.26ppm，沸點 60.8°C，100ml ￥520 其它常見氘代溶劑：CD3COCD3，CD3OD，DMSO－d6（可以打出活潑氫），C5D5N 因為測試時溶劑中的氫也會出峰，溶劑的量遠遠大於樣品的量，溶劑峰會掩蓋樣品峰，所 以用氘取代溶劑中的氫，氘的共振峰頻率和氫差別很大，氫譜中不會出現氘的峰，減少 了溶劑的干擾。在譜圖中出現的溶劑峰是氘的取代不完全的殘留氫的峰。另外，在測試 時需要用氘峰進行鎖場。 由於氘代溶劑的品種不是很多，要根據樣品的極性選擇極性相似的溶劑，氘代溶劑的極 性從小到大是這樣排列的：苯、氯仿、乙腈、丙酮、二甲亞碸、吡啶、甲醇、水。還要 注意溶劑峰的化學位移，最好不要遮擋樣品峰。 準備樣品 1. 首要的是保證產物的純度，雜質峰肯定讓你的圖不好看。 2. 拿住樣品管是要拿住上部。 3. 實驗過程中的溶劑殘留也是影響圖譜品質的很大因素。常見的有石油 醚、乙酸乙酯 等溶劑。 4. 對於氫譜，3 到 10 毫克樣品足夠。對於分子量較大的樣品，有時需要濃度 更大的 溶液。但濃度太大會因飽和或者粘度增加而降低解析度。 5. 對於碳譜和雜核 譜，樣品濃度至少為氫譜的 5 倍（一般在 100 毫克左右）。 6. 對於二維實驗，為了獲得較好的信噪比，樣品濃度必須夠。根據經驗，25 毫克樣 品足以完成所有實驗，包括氫碳相關 HMBC 實驗。如果樣品只有 1 到 5 毫克，只 能完成同核氫氫相關實驗，與碳相關的實驗至少需要過夜。保持樣品高度或者體積 一致。這將減少換樣品後的勻場時間。對於 5 毫米核磁管，樣品體積應為 0.6 毫升 或者樣品高度為 4 釐米。 7. 保持樣品高度或者體積一致。這將減少換樣品後的勻場時間。 8. 蓋上樣品管，使用封口膜密封減少蒸發。 關於樣品純化 1. 過柱子，過柱子，重要的事情說三遍。再好分都過根柱子，過柱子的時候勤換瓶 子，產物點分幾瓶接，取中間的旋乾燥送核磁。 2. 國內一般石油醚用的多一點，國外正己烷多一點，可以的話用正己烷，正己烷相對 而言比較乾淨... 3. 旋蒸其實不能把溶劑完全蒸完，可以考慮最後用真空泵抽一下，這樣會使溶劑峰更 低。二氯石油醚，那麼抽個半小時就差不多沒了；如果有乙酸乙酯，DMF，乙腈甲 醇等沸點比較高的溶劑，先高溫把溶劑旋乾淨，然後趁熱抽，再常溫抽幾個小時， 基本上溶劑峰就沒了。水峰一般也比較容易抽沒。 4. 注意潛在的油脂類雜質：如果東西比較少，處理的時候又不太注意，在氫譜上位移 1.2 和 0.8 會有兩個油脂的雜峰，很影響美觀。這種情況一般可以用石油醚洗兩次 產物，然後抽乾，油脂大部分會被石油醚洗掉。 5. 氘代試劑平時可以放在乾燥箱裡，防止引入水分。 參考資料： 製備高品質液體核磁樣品--核磁制樣三要素，王巍 向俊鋒 過柱心得參考知乎網友，封面來源知乎 Qing。 H NMR 溶劑化學位移 chemical shift (ppm) 1 13 C NMR 溶劑化學位移 chemical shift (ppm) 樣品可⽤溶劑表 Acetic Acetic Acid-d4 Acetone Acetone-d6 C6D6 Bezene-d6 CD2Cl2 Dichlormethane-d2 CD3CN Acetonitrile-d3 CD3CN_SPE LC-SPE solvent (Acetonitrile) CD3OD_SPE LC-SPE solvent (Methanol-d4) CDCl3 Chloroform-d CH3CN+D2O HPLC solvent (Acetonitrile/D2O) CH3OH+D2O HPLC solvent (Methanol/D2O) D2O Deuterium oxide D2O_salt Deuterium oxide with salt DMF N,N-dimethylformamide-d7 DMSO Dimethylsulfoxide-d6 Dioxane Dioxane-d8 Juice Fruit Juice MeOD Methanol-d4 None No solvent Plasma Blood plasma Pyr Pyridine-d6 TFE Trifluroethanol-d3 THF Tetrahydrofuran-d8 T_H2O+D2O+Me4NCL (CD3)4NCl in for NMR thermometer 90%H2O and 10%D2O T_H2O+D2O+NaAc sodium acetate in 90%H2O and 10%D2O for NMR thermometer T_H2O+D2O+Pivalate pivalate –d9 in for NMR thermometer 90%H2O and 10%D2O T_MeOD Metanol-d4 for NMR thermometer Tol Toluene-d8 Urine Urine oC6D4Cl2 ortho-dichlorobenzene-d4 pC6D4Br2 para-dibromobenzene-d4