体外培养的小鼠抗原负载树突状细胞的形态学特征.pdf
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现代生物医学进展 www.biomed.net.cn Progress in Modern Biomedicine 2009 Vol.9 No.21 · 4057 · 体外培养的小鼠抗原负载树突状细胞的形态学特征 * 宏 杰 1 宋承鑫 1 姜 哲 2 贾立敏 1 贺业春 1 谢遵江 1△ 2 黑龙江护理高等专科学校 黑龙江 哈尔滨 150086） （1 哈尔滨医科大学 解剖学教研室 黑龙江 哈尔滨 150081； 摘要 目的：研究体外培养的小鼠抗原负载树突状细胞(dentritic cells, DCs)的形态学特征，为肿瘤的生物学治疗提供形态学基础。 方法： 分离和培养 DC， 制备 B16 黑色素瘤细胞抗原， 进行共培养， 即为抗原负载的 DC。建立 B16 黑色素瘤小鼠模型， 于瘤周围皮 下注射抗原负载的 DC。应用光镜、 免疫组化方法和透射电镜观察抗原负载 DC 的形态学特征。结果： 培养的抗原负载 DC 与 DC 比较，体积较大，表面突起较粗大且弯曲。免疫组化染色显示抗原负载树突状细胞主要分布于肿瘤周围皮肤的乳头层、网织层和 肿瘤周围， 于局域淋巴结的被膜下窦和副皮质区有散在分布。电镜下抗原负载 DC 细胞体积较大，核有切迹，细胞表面的突起，与 肿瘤细胞和淋巴细胞接触密切。结论：抗原负载 DC 表现出比一般树突状细胞功能更加活跃的形态特征， 冻融法全细胞来源的肿 瘤抗原负载 DC 可以获得理想的 DC 疫苗。 关键词：小鼠； 抗原负载；树突状细胞； 形态学 R392.12 中图分类号：Q95-3， 文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2009）21-4057-03 Morphological Characteristics of the Cultured Antigen-loaded DC of Mice in Vitro* HONG Jie1, SONG Cheng-xin1, JIANG Zhe2, JIA Li-min1, HE Ye-chun1, XIE Zun-Jiang1△ （Department of Anatomy, Harbin Medical University, Harbin 150081, China） ABSTRACT Objective: To investigate the morphological characteristics of the cultured antigen-loaded DC of mice in vitro. It will provide morphological basis for the tumor biological therapy. Methods: DCs were separated and cultured, tumor antigen was extracted from B16 melanoma cells by method of freeze thawing, and then they were co-cultured. The co-cultured cells were antigen-loaded DC. The mouse model of B16 melanoma was established, and antigen-loaded DCs were injected into the tumor-surrounding tissues. The morphology of antigen-loaded DCs was observed by optical microscopy, electron microscopy and immunohisochemistry. Results: The antigen-loaded DC cells were bigger than the DC cells, and protrusions on the surface of antigen-loaded DC were more grossus and curved. The antigen-loaded DC cells mainly distributed in the tumor-surrounding tissues and regional lymph nodes by immunohisochemistry. Under electron microscopy, the antigen-loaded DC cells were bigger than the DC cells and notch always appears on cellular nucleus was observed. The protrusions on the surface of antigen-loaded DC cells contacted closely with tumor cells or lymphocytes. Conclusion: The morphological characteristics of antigen-loaded DC on function were more active than DC. These results suggested that the antigen-loaded DC was a good vaccine. Key words: Mouse; Dendritic cell (DC); Antigen-loaded DC; Morphology Chinese Library Classification: Q95-3, R392.12 Document code: A Article ID: 1673-6273（2009）21-4057-03 DC 及抗原负载 DC 诱导机体抗肿瘤效应仍缺乏形态学证据[1]。 前言 有关 DC 的研究较多，多集中在肿瘤的生物学治疗方面，以及 20 世纪 90 年代以来， 随着对 DC 扩增方法的研究，已经可 DC 的表型、来源、分化发育过程和功能等方面的研究，但有关 以在体外获得可观数量的 DC，这为以 DC 为基础的肿瘤疫苗 DC 特别是抗原负载 DC 的形态学研究较少[2]。本文采用光镜、 的研究提供可能。DC 作为功能最强的抗原递呈细胞， 为肿瘤的 电镜和免疫组织化学的方法, 对小鼠体外培养的抗原负载 DC 免疫治疗提供了新的方向。以 DC 为基础的肿瘤疫苗是目前诱 的形态和分布特征进行研究，为进一步研究其功能和生物学治 导抗原特异性 CTL 产生免疫反应的最有效方法，尽管目前以 疗提供形态学基础， 为临床应用提供依据。 DC 为基础的肿瘤疫苗临床试验取得了令人鼓舞的结果，但仍 需要更多的研究来证实它的效果。同时，这一治疗途径还存在 着许多需要解决的问题，例如，使用的途径、剂量、注射的频率， 使用哪一种 DC 亚型更好，等等，同时 DC 递呈抗原的过程和 1 材料与方法 1.1 材料 IL-2 和 GM-CSF 均购自美国 PEPRO TECH 公司； S-100 蛋 * 基金项目：黑龙江省教育厅科研项目（11511186） 作者简介：宏杰（1970-），男，硕士研究生，工作单位：内蒙古民族大学附属医院， 主要研究方向：肿瘤免疫 △通讯作者：谢遵江，电话： 0451-86674508，E-mail: xiezj555@hotmail.com。 2009-09-05 接受日期：2009-09-30） （收稿日期： · 4058 · 现代生物医学进展 www.biomed.net.cn Progress in Modern Biomedicine 2009 Vol.9 No.21 白抗体和免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公 围组织。局部输入 12 小时后， 于局域淋巴结的被膜下窦和副皮 司；RPMI1640 培养液、青霉素 - 链霉素购自美国 HYCLONE 24h～3 天数量达最高峰（图 3）。 质区有散在分布， 公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司； B16-F10 黑 色 素 瘤 细 胞 购 自 哈 尔 滨 医 科 大 学 肿 瘤 研 究 所 ； C57BL/6N 小鼠（8 周龄，雌性，体重 16～22g， 20 只）由北京维 通 利 华 实 验 动 物 技 术 有 限 公 司 提 供 （合 格 证 号 ：SCXK 京 2004-0001）。 1.2 方法 1.2.1 树突状细胞的分离和培养 菌条件下提取小鼠股骨骨髓 细胞（方法参考文献[3]），放入 PRMI1640 培养液（含 10%胎牛血 0.1ml 青 - 链霉素） 中吹打混匀， 3h 后取贴壁细胞加入 IL-4 清， （终浓度为 500U/ml） 和 GM-CSF （终浓度为 1000U/ml），于 370C、5% CO2 培养箱中培养。每 3 天半量更换 1 次培养液，同 时加入 GM-CSF 和 IL-4。 1.2.2 肿瘤全细胞抗原和抗原负载树突状细胞的制备 消化、收 图 1 培养 3d 后的抗原负载树突状细胞 (400×) Fig. 1 Antigen-loaded DC cultivated for three days (400×) 集对数生长期的 B16 黑色素瘤细胞，离心、 洗涤、封装入冻存管 内。将冻存管缓慢放入液氮内 10min，取出立即放入 37 ℃水浴 箱中 10min， 重复 3 次。再放入离心机中离心 3000r/min 10min， 取上清液，-20℃保存备用。在 DC 培养的第 6d 加入上述的肿 瘤抗原，共培养 3d 后，即为抗原负载的树突状细胞，倒置相差 显微镜观察。 1.2.3 动物模型的建立及免疫细胞的注射 将黑色素瘤细胞复 苏后培养、传代，取对数生长期细胞消化，离心并调整细胞浓度 为 1x106/ml。取 0.2ml 注射到 C57 小鼠左肩部皮下，注射后 8～ 10d 小鼠皮肤长出直径 0.2~0.4cm 的肿瘤，在小鼠肿瘤周围皮 下注入 0.1ml 抗原负载的树突状细胞。 1.2.4 免疫组织化学染色 在注射抗原负载的树突状细胞后 图 2 抗原负载树突状细胞在肿瘤组织周围免疫组化染色 (400×) Fig. 2 Antigen-loaded DC in the tumor-surrounding tissues stained by immunohistochemicamisty (400×) 3d，处死全部小鼠，取肿瘤与正常交界处皮肤及局部淋巴结。 4%多聚甲醛固定， 常规石蜡包埋、切片。常规免疫组化染色， 一 抗为大鼠抗小鼠 S-100 蛋白单克隆抗体，DAB 显色，光镜观 察。以上各项操作均严格按照试剂盒说明书进行。 1.2.5 透射电镜观察 取肿瘤与正常组织交界处皮肤及局部淋 巴结，常规透射电镜样品制备，半薄和超薄切片，醋酸铀 - 柠檬 酸铅双重染色。JEM-1220 透射电镜观察。 2 结果 2.1 体外培养的抗原负载树突状细胞的相差显微镜观察 与肿瘤冻融抗原共培养的树突状细胞，培养 3 天后，呈现 典型的成熟树突状细胞形态。肿瘤抗原负载的树突状细胞，体 积较大， 直径在 15~25μm 之间，比体外培养的树突状细胞体积 图 3 抗原负载树突状细胞在局部淋巴结免疫组化染色 (400×) Fig. 3 Antigen-loaded DC in the lymph nodes stained by immunohistochemicamisty (400×) 略大。细胞呈星形或梭形，细胞核清晰可见，胞质丰富，细胞呈 悬浮生长状态，较饱满透亮，细胞表面有许多突起，突起与体外 培养的树突状细胞比较，较粗大， 而且较弯曲（图 1）。 2.3 体外培养的抗原负载树突状细胞注入体内后的电镜观察 透射电镜下， 抗原负载的树突状细胞比培养的树突状细胞 2.2 肿瘤局部注射抗原负载树突状细胞的免疫组织化学染色 体积略大，细胞质丰富，可见线粒体和内质网密集，有吞噬颗 观察 粒，细胞核椭圆形或呈肾形和不规则形，核染色质聚集，成块 抗原负载树突状细胞被染成棕黄色，体积较大，细胞质着 状， 核膜清晰。肿瘤组织周边的淋巴管内的抗原负载树突状细 色明显，细胞形态不规则，细胞表面可见长突起。局部输入后 胞，细胞核形态不规则，有明显的切迹，胞质内细胞器较多，细 12～24 小时，抗原负载树突状细胞主要分布于肿瘤周围皮肤 胞表面突起粗大。血管内的抗原负载树突状细胞，细胞形态不 的乳头层、网织层和肿瘤周围（图 2）。24 小时以后主要集中于 规则，细胞核亦不规则，核仁清晰可见，染色质边集；与癌细胞 肿瘤的周围、癌巢的边缘区、类高内皮微静脉和淋巴管内及周 接触的抗原负载树突状细胞出现核切迹，有的形成深切迹，有 现代生物医学进展 www.biomed.net.cn Progress in Modern Biomedicine 2009 Vol.9 · 4059 · No.21 的细胞质增多，核呈圆形，细胞质或突起内有大量的扩张的内 性， 但该方法只适用于少数特异性抗原已经得到明确鉴定的肿 质网和小线粒体，线粒体嵴紊乱或空泡变，细胞质中细胞器有 瘤，因而限制了它的临床应用。②肿瘤抗原基因转染的 DC 疫 极性表现（图 4）。局部淋巴结内的抗原负载树突状细胞，细胞 苗是将肿瘤相关抗原基因导入 DC，可使 DC 持续表达该抗原， 体积较大，淡染，细胞质丰富，细胞质内可见许多线粒体，线粒 从而诱导出持续特异性免疫反应，解决了大多数抗原肽半衰期 体呈圆形，嵴紊乱，细胞核不规则，染色质凝集成块，粗大的细 很短，无法持久诱导免疫反应的问题，但由于目前对肿瘤抗原 胞质突起发出分枝与淋巴细胞紧密接触， （图 5）。 基因了解很少，所以同样也存在无法针对未知抗原的问题。③ 全细胞来源的肿瘤抗原修饰的 DC 疫苗是用全部细胞来源的 抗原（细胞裂解物、提取物、完整的肿瘤细胞等）修饰 DC，因而 能针对大多数未知肿瘤抗原，并且容易获取和制备，有较大的 临床应用潜力。 本实验选择了简便易行的反复冻融法从全细胞中提取可 溶性黑色素细胞瘤抗原来负载 DC，制成全细胞来源的肿瘤抗 原修饰的 DC 疫苗，并观察其分布和形态学特征。研究结果显 示， 于肿瘤边缘区、 肿瘤周围皮肤的网状层、局部淋巴结的被膜 下窦和副皮质区有大量 S-100 蛋白阳性表达细胞，这些细胞体 积大， 细胞形态不规则，细胞表面有长突起。S-100 蛋白主要表 巨噬 达于树突状细胞、巨噬细胞和淋巴细胞。淋巴细胞小而圆， 图 4 抗原负载树突状细胞 TEM(3500×) 细胞体积更大，细胞表面有细长绒毛样突起，明显区别于树突 K:抗原负载树突状细胞 L:淋巴细胞 状细胞，可以确定这些阳性表达细胞为肿瘤抗原负载树突状细 Fig. 4 Antigen-loaded DC TEM (3500×) 胞。电镜下与未经抗原负载的 DC 相比 ，DC 形态不规则， 细胞 K: antigen-loaded DC L: lymphocytes 表面突起粗大，细胞质丰富，细胞器较多，线粒体和内质网密 集， 有吞噬颗粒， 细胞核呈椭圆形或呈肾形或不规则形，出现核 切迹，核染色质凝集，成块状，核膜清晰，与癌细胞和淋巴细胞 广泛接触。结果表明抗原负载的树突状细胞具有比一般树突状 细胞功能更加活跃的形态特征。从而证实了冻融法全细胞来源 的肿瘤抗原修饰 DC 可以获得理想的 DC 疫苗。 树突状细胞抗原递呈和激活 T 细胞的过程由三个步骤组 成。首先外周未成熟的树突状细胞接受抗原刺激，然后迁移至 淋巴组织成为成熟的树突状细胞，最后树突状细胞在淋巴组织 内活化 T 细胞[6]。 24h、48h、3 天、 5 天、 7 本研究对抗原负载 DC 回输后 12h、 天的癌周皮肤、 癌巢周边和癌巢以及局域淋巴结进行透射电镜 图 5 抗原负载树突状细胞 TEM(5000×) 观察，发现位于不同部位的不同阶段的抗原负载 DC 具有不同 K:抗原负载树突状细胞 T:肿瘤细胞 的形态。局部回输后 12~24 小时癌周皮肤的乳头层、网织层抗 Fig. 5 Antigen-loaded DC TEM (5000×) 原负载 DC 体积较大，淡染，细胞质较丰富，胞质突起粗大，细 K: Antigen-loaded DC T: tumor cell 胞核多呈椭圆形或肾形，有切迹，核染色质均匀、浅淡，异染色 质边集。12~48 小时癌巢周边和边缘区有的抗原负载 DC 出现 3 讨论 肿瘤细胞表面存在可被免疫系统识别而不同于正常细胞 的肿瘤抗原，这些肿瘤抗原可以被机体免疫细胞识别，从而产 生特异性的抗肿瘤免疫应答。肿瘤抗原的识别必须有抗原提呈 细胞(APC)的参与。DC 作为一种最重要的 APC 在肿瘤生物治 DC 疫苗已经在非霍奇金淋 疗中的作用，日益受到人们的重视， 巴瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、前列腺癌和肾癌[4]等部分恶性 疾病治疗中取得了了令人振奋的疗效。本实验研究了冻融法全 核切迹，染色质凝集，细胞质增多，粗大的突起发出分枝状小突 起。这提示位于癌巢周边和边缘区抗原负载 DC 的形态较癌周 组织内的 DC 趋向成熟，推测抗原负载 DC 可能不用从癌细胞 接受抗原信息，从而直接诱导和激活效应 T 细胞，因此缩短了 树突状细胞提呈抗原诱导特异性和高效的 CTL 进行主动特异 性抗肿瘤时效。 局域淋巴结副皮质区的抗原负载树突状细胞体积较大，核 有切迹，大多数有 1~2 个核仁，细胞质丰富，有发达的线粒体、 细胞抗原负载 DC 在体外培养和在 B16 黑色素瘤模型鼠体内 丰富的内质网和糖原颗粒。此处的 DC 与癌周围的 DC 的形态 相比较差异很大，提示此时的抗原负载 DC 已经处于成熟状 的分布及形态学特征。 态。抗原负载树突状细胞的细胞突起与周围淋巴细胞紧密接 目前 DC 介导的疫苗主要有肿瘤抗原肽修饰的 DC 疫苗、 肿瘤抗原基因转染的 DC 疫苗以及全细胞来源的肿瘤抗原修 触，或形成树突状细胞淋巴细胞环，且多数淋巴细胞呈活化状 态。这些都提示抗原负载 DC 可能向淋巴细胞传递某种信息， 饰的 DC 疫苗三大类[5]。①肿瘤抗原肽修饰的 DC 疫苗是用已 而且我们推测这种抗原负载树突状细胞对淋巴细胞抗原信息 知肿瘤抗原肽修饰 DC，因为抗原表位明确而具有很好的靶向 的递呈比树突状细胞可能更有效。 （下转第 4076 页） · 4076 · 现代生物医学进展 www.biomed.net.cn Progress in Modern Biomedicine 2009 Vol.9 No.21 本中均有不同程度的甲基化，而且进一步的体外去甲基化干预 表明: 导致 p73 基因在恶性淋巴瘤组织中表达缺失或者下降的 实验发现，运用常规的去甲基化因子 5-Aza，能够有效的恢复 主要原因是基因编码区的过度甲基化。 p73 基因的转录水平，且在一定范围内呈量效关系。这些结果 图 3 不同浓度 5-Aza 处理细胞后，p73 基因表达变化 M： 100bp DNA Ladder Marker; 1: 0μmol/L; 2: 4μmol/L; 3: 8μmol/L; p73: 390bp β-actin: 260bp Fig .3 The expression of p73 gene after the treatment of 5-Aza with different concentration 100bp DNA Ladder Marker; 1: 0μmol/L; 2: 4μmol/L; 3: 8μmol/L; p73: 390bp β-actin: 260bp M： 综上所述，p73 基因的沉寂与 NHL 的发病密切相关。P73 基因编码区 CpG 的过度甲基化是导致 p73 基因沉寂的主要原 因，而且去甲基化干预能够有效的促进 p73 基因的再表达。本 gene in the network of tumor suppressors [J]. 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