青蒿素及其衍生物的抗疟机制研究进展.pdf
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第 19 卷 第1期 2009 年 1 月 25 青蒿素及其衍生物的抗疟机制研究进展* 韩利平1 黄 强2 曾丽艳1 钟 扬1 卫海滨1 南 蓬1* * 1. 复旦大学生命科学学院; 2. 复旦大学遗传工程国家重点实验室, 上海 200433 摘要 青蒿素及其衍生物是一类重要的抗疟药物, 其分子结构中含有特殊的过氧桥键. 近几十年 来, 青蒿素及其衍生物的抗疟机制引起了国内外科学工作者浓厚的兴趣. 文中结合最新的研究结果, 综述了青蒿素及其衍生物的抗疟机制. 研究进展表明, 该类衍生物的抗疟机制基本分为两步: 首先, 青蒿素及其衍生物在疟原虫体内的 Fe( ) 或其他还原性物质作用下形成一些活性中间体; 然后, 这些 中间体通过过氧化膜脂质、干扰线粒体的功能、烷基化血红素或抑制蛋白质活性等途径表现出抗疟作 用. 作者对 3 种可能的活性中间体学说以及作用靶点进行了详细的讨论, 并提出了下一步的研究方 向. 通过对青蒿素及其衍生物抗疟机制的论述, 为今后抗疟药物的设计提供帮助. 关键词 青蒿素 活性中间体 靶点 抗疟机制 青蒿素( art emisinin) 是从植物黄花蒿( A rtemi sia annua L. ) 中提取的 一种含过氧键的 特殊倍 半萜内 [ 1] 酯 ( 图 1) . 该类衍生物抗疟作用迅速、高效, 选择 性好, 且临床上未见明显抗性. 尽管存在水溶性差与 半衰期短的缺点, 但它们仍然是目前一类重要的抗疟 果作了系统的探讨, 并提出了下一步的研究方向. 1 活性中间体的形成机制 众多研究表明, 该类化合物所含的过氧基团是 药. 由于青蒿素与以往其他抗疟药物的结构完全不 抗疟活性的关键, 因为缺少过氧键的脱氧青蒿素则 无抗疟活性. 选用密度泛函理论对青蒿素和脱氧青 同, 自 20 世纪 70 年代问世以来, 其抗疟机制引起了 国内外科学工作者浓厚的兴趣. 迄今为止, 对于青蒿 蒿素进行比较研究 , 发现两者在电荷分布、分子 轨道能级及分布上存在显著差异, 理论上证实青蒿 素类化合物的抗疟机制尚无明确的定论. 素类衍生物的抗疟活性与过氧键有关. 根据有机化学理论, 过氧化物的过氧键通常有强 [ 2] 烈的氧化性, 易与还原性物质( 如金属化合物) 反应而 断裂. 研究了 35 种 10 位 C 醚类及酯类取代( 图 1) 的 青蒿素衍生物的构效关系, 结果显示过氧桥是青蒿素 类衍生物与受体结合的负电中心, 其电负性越高, 衍 生物的活性越高, 支持了过氧桥的断裂机制. 那么, 图1 青蒿素的结构式 本文从青蒿素及其衍生物抗疟可能的活性中间 体、作用机制等方面进行综述, 对近年来的研究成 青蒿素类衍生物在过氧键断裂之后, 会形成什么活性 中间体呢? 以下是几种可能的活性中间体学说. 1. 1 形成碳自由基中间体 疟原虫主 要从宿主 红细 胞的血 红蛋白 ( hem o 2008 04 21 收稿, 2008 06 26 收修改稿 * 国家 八六 三 计 划( 2006A A02Z344, 2007A A 02Z332) 、国家 重点 基础 研究 发展 计划 ( 2002CB512801) 及上 海 市重 点学 科建 设项 目 ( B111) 资助项目 * * 通信作者, E mail : nanpeng@ fu dan edu cn 第 19 卷 第1期 75% 得到仲碳自由基( 二级碳自由基) , 而 2 位氧自由基没 的宿主血红蛋白被消化分解成氨基酸, 以合成疟原 虫自身所需的蛋白质, 同时还产生大量的亚铁血红 有 H , 无法进行氢迁移, 发生 裂解生成伯碳自由 基( 初级碳自由基) , 反应历程及中间体如图 2 中途径 26 g lobin) 中摄取营养. 早期的研究发现, 25% [ 3] 素( heme) . 亚铁血红素是 由 F e( ) 和卟啉 环构 成, 亚铁原子共有 6 个配位键, 其中空着一个配位 2009 年 1 月 A 所示. 之前只是推测碳自由基可能为中间体, 而该 键可促进过氧化物的分解 , 人们推断当青蒿素作 研究则为碳 自由基中间体的存在提供了确凿 证据. Artef lene 为第二代青蒿素衍生物中最有发展前景的新 用于疟原虫时, 虫体内丰富的亚铁血红素可能会使 其过氧键断裂生成自由基. 体外实验发现 [ 5] , 提高 型抗疟 药 之一, 对 鼠疟 的 体 外 活 性超 过 青 蒿 素. O Neill 等[ 13] 用 EPR 检测发现Artef lene与 Fe( ) 的反 氧化应激的药物( 如阿霉素等) 与青蒿琥酯具有协同 抗疟作用. 反之, 过氧化氢酶、DT T 等抑制氧化应 应中间体同样是碳自由基. 通过不断地深入和完善, [ 4] 激作用的物质则降低了青蒿素的抗疟效果. 最直接 [ 6] 的证 据 是 Meshnick 等 用 电 子顺 磁 共 振波 谱 法 ( EPR) 首次捕获到青蒿素与 Fe( NH 4 ) 2 ( SO 4 ) 2 共存 时的自由基信号. 他们还发现铁鳌合剂拮抗青蒿素 的抗疟活性. 吴文敏等[ 7] 观察到 Fe( ) 不能诱导青 蒿素形成自由基, 表明 F e( ) 为还原性引发剂. 随 后 Posner [ 8] 和 Jeff ord 等 [ 9] 的研究建立了 Fe ( ) 诱 人们已普遍接受 Fe( ) 催化过氧键断裂后形成碳自由 基是青蒿素类化合物抗疟机理的第一步. 需要强调的是, F e( ) 催化青蒿素异构化的主 要产物取决于选用的铁盐、催化剂的量以及溶剂. 不同研究小组报告的裂解产物不尽相同, 而且由化 学试剂营造的实验模型并不能完全等同于疟原虫体 内的生物环境. 这难免会造成对青蒿素机理认识的 含糊不清, 甚至出 现矛盾. 一些 青蒿 素衍 生物被 导青蒿素类衍生物产生自由基的模型. 由于化合物 的不对称结构, 过氧桥键断裂后分别在 1 位 O 和 2 F e( ) 还原生成自由基后, 不可能通过氢迁移转化 为碳自由基, 但它们却具有体外抗疟活性, 有些甚 位 O( 图 1) 形成两种不同的氧自由基. 同时, 氧自 至与青蒿素相当[ 14] . 13 位 O( 图 1) 被 C 取代的类似 由基通过 1, 5 氢迁移或碳 碳键裂解重排为热力学 上更稳定的碳自由基. 研究结果提示青蒿素类化合 物与青蒿素结构非常相似, 由于青蒿素环结构的刚 性特征, 根据抗疟机理预测, 其抗疟活性与青蒿素 物的抗疟作用可能是因为 F e( ) 介导产生了 自由 相比不会发生明 显变 化, 但 该类 似物 并无 抗疟活 基, 碳自由基可能是最终活性中间体. 科学家们基于此机理设计并合成了 3 种不同的 性 . 双氢青蒿素的某些氨基衍生物是体内抗鼠疟 较好的一类化合物, 但在 H 2 O/ C2 H 3 N ( 1 1) 的溶 烷青蒿 素类似物 [ 10] . 剂中与 F e( ) 反应极其缓慢和迟钝. 由此可见, 产 生碳自由基的反应能力与它们的抗疟活性没有必然 4 位 C( 图 1) 甲基取代 的三 可以发生 1, 5 氢迁移重排为碳自由基的 类似物其 抗疟活性远远大于无法发生 1, 5 氢迁移的类似物, 实验结果 支持了碳 自由基 为活性 中间体 的抗疟 机 理. 吴毓林等在这方面也做了大量的研究, 他们合 成了一对差向异构体 [ 11] . 其中一个异构体在催化量 的 Fe( ) 作用下可以形成碳自由基, 抗鼠疟 K173 株的活性较高; 而另外一个几乎对 F e( ) 表现出惰 [ 15] [ 16] 的相关性 . 这些现象显然无法用碳自由基中间体 理论来解释. 科学家从塞内加尔的疟疾病人血样中 发现疟原虫 已经开始 表现出 逃避青 蒿素攻 击的能 [ 17] 力, 也间接说明了自由基学说的不可靠性 . 一些 研究人 员 甚 至认 为 青 蒿 素 的 抗 疟 作 用 不 依赖 于 性, 对鼠疟 K173 株的抑制作用较差. 表明生成碳 heme F e( ) . 疟原虫通常在含有 1% O2 的环境下 生长, 将 O2 提高到 20% 模拟氧化性环境, 或者加 自由基与抗疟活性之间存在一定的相关性, 进一步 证实碳自由基是抗疟作用的重要活性中间体. 入 2% CO 络合体系中的 hem e Fe( ) , 形成还原性 环境. 不论是在 20% O2 还是在 2% CO 的体系中, 随着检测技术的不断改进, 青蒿素类化合物的抗 青蒿素的抗疟作用都比正常环境高. 据此判断, 青 [ 12] 疟机制也取 得了很大 的进展. 吴毓 林等 最 先用 ESR 捕获到碳自由基信号. 实验结果表明青蒿素和 蒿素抗疟作用并不一定需要 hem e Fe( ) 参与, 也 不是自由基发挥的作用 [ 20] . 所以碳自由基中间体机 Fe( ) 作用首先产生两种氧自由基, 随后迅速重排为 两种碳自由基. 其中 1 位氧自由基发生 1, 5 氢迁移 制并不是无懈可击, 因而有些学者提出了不同的活 性中间体. 第 19 卷 第1期 2009 年 1 月 27 图 2 亚铁离子催化青蒿素生 成活性中间体的机制图 [18, 19] 1. 2 形成 Fe( ) = O 和环氧化物中间体 青蒿素类衍生物另一种可能的断裂机理见图 2 途 为易于环氧化富电子的碳碳双键[ 23] . 对三 烷相似 [ 24] 物的结构 活性关系( 图 3) 进行分析不难发现 , 3a 径 B. 高价的 Fe( ) = O 中间体是由仲碳自由基 1 经 历 裂解形成的, 同时还产生了亲电性极强的环氧化 与 3b 的结构只有一个原子之差, 但 3a 具有显著的活 性, 而 3b 基本没有活性. 在 FeBr 2 还原裂解下分别 物 3, 3 不稳定, 很容易被 游离的氢 氧基进 攻发生 与 H MDB 的反应, 加入 3a 出现 H MDB 的重排产物, SN1 反应开环, 产物为 4. 其中, Fe( ) = O 具有金 属单氧化酶的特性, 可以引起生物大分子的氧化性损 但加入 3b 无反应. 这是因为 3b 产生的 C 4 自由基发 生选择性 裂解时, 由于 Me 3 Sn 的离去倾向大于 伤. 3 是烷化剂, 可通过烷基化作用造成虫体死亡. Fe( [ 21] ) O , 优 先 离 去 基 团 为 M e3 Sn 而不是 Posner 等最先提出上述 机理 . 当 把青蒿素、 FeBr 2 和六甲基杜瓦苯( HMDB) 在 T H F 溶剂中反应 Fe( ) O , 从而形成了其他的 裂解产物, 即没有 经过 Fe( ) = O 中间体. Fe( ) = O 中间体机理可以 后, H MDB 重排为环己苯( H B) . 将苯硫基甲烷加入 合理地解释 3b 无抗疟活性的现象. 青蒿素、FeBr 2 / T H F 的反应体系中, 苯硫基甲烷被 氧化成亚砜. 如加入萘满则可被氧化为四氢萘酚. 这 此外, 用 Fo urier 转换红外线光谱( F T IR) 研究 青蒿素与血红素二聚体之间的还原反应[ 25] . IR 谱上 些反应均为 Fe( 850cm - 1 处出现 Fe( ) = O 的存在提供了依据. 早期的 研究也已经清楚地阐明了血红素催化烯烃环氧化物的 中间体为 Fe( ) = O[ 22] . 而且, Fe( ) = O普遍被认 ) = O 的伸缩振动, 3500 cm - 1 - 1 处的 ( OH ) 和 1728 cm 处的 ( C= O) 信号峰证实 了 3 的存在. H PL C/ M S 法测得蒿甲醚在老鼠肝微 第 19 卷 28 粒体中的代谢产物之一是最终产物 4 [ 26] . 第1期 2009 年 1 月 用下产生一些活性中间体( 包括自由基、Fe( ) = O、 亲电中间体和活 性氧等) . 这些中间 体通过过氧化 膜脂质、干扰线粒体的功能、烷基化、与疟原虫的 蛋白质作用等途径杀死疟原虫. 2. 1 过氧化疟原虫细胞膜 显微镜观察14 C 标记的青蒿素和3 H 双氢青蒿素对 疟原虫超微结构的影响, 作用 4 h 后核糖体消失, 疟原 虫的食物泡遭到破坏[29] , 这是典型的自由基过氧化反 图 3 三 烷青蒿素类似物的结构式及其抗 NF54 的体外活性 尽管有证据支持 Fe( ) = O 中间体学说, 仍有 部分学者提出质疑. 用 FeCl2 4 H 2 O/ T H F 与青蒿 素反应, 同时加入 1 当量的环己烯, 产物中却没有环 己烯 的环 氧 化物[ 9] . 因 而, Jeff ord 认 为[ 9] 证 明 Fe ( ) = O 中间体存在 H MDB 反应、苯硫基甲烷及萘 满的氧化反应可能是人为的偶然性氧化行为 从全合 成的 13 位碳取代青蒿素类似物中体外筛选抗疟化合 [ 15] 物, 3c( 图 3) 的活性较好 . FeBr 2 催化 3c 的产物为 39% 的环己酮和 20% 的环氧化物, 但产物都无活性, 这说明环氧化物与抗疟活性无关, 很可能通过碳自由 基作用. 综合考虑, 环氧化物不太可能是疟原虫的 杀手 . 碳自由基仍然是最有可能的活性中间体. 1. 3 形成碳正离子中间体 Fe( ) 或者其他的 L ew is 酸能够进攻青蒿素过 氧键使其开环异裂为 C 3 正离子, 随后获取氢成为 过氧化物[ 18] , 最终产生具有细胞毒性的自由基. 这 是青蒿素 类化合物 形成另 一种活 性中间 体的机 制 ( 图 2 途径 C) . 抗疟化合物 磺酰基过氧化物可以 在 Fe( ) 盐作用下通过单电子转移过氧化碳自由基 中间体成 为碳正离 子[ 27] . 但奇 怪的是, 青蒿素 在 37 时与 H 2 O/ H Ac 体系( pH = 2 1) 反应 18 h 无变 化[ 19] . 两个结构类似的青蒿素相似物经过异裂作用 后形成相同的碳正离子, 抗 W 2 和 D 6 疟原虫株的 [ 14] 活性却不同 . 用 DFT 计算研究青蒿素和蒿甲醚 在 L ew is 酸进攻的作用机理. 理论研究认为有利的 Lew is 酸质子化位点均为 5 个氧原子, 不可能形成 [ 28] 3 位碳正离子 . 关于形成碳正离子中间体的抗疟 机制目前尚缺乏足够的证据. 2 活性中间体的抗疟机制 青蒿素类衍生物在 Fe( ) 或者其他还原性物质作 应. 疟原虫体内的血红素可以催化青蒿素产生大量的 自由基. 自由基过氧化细胞膜上的不饱和脂肪酸, 这 不仅能够促进疟原虫体内红细胞的衰老和溶解, 而且 还可以导致膜组分和结构的改变. 有实验证实在血红 素诱导下青蒿素加重了疟原虫膜的损伤[ 30] . 因而, 青 蒿素类衍生物能引起疟原虫细胞膜损伤, 导致其食物 泡破裂, 从而使疟原虫开始自消化直至死亡. 2. 2 干扰线粒体功能 青蒿素衍生物产生抗疟作用时, 除了影响疟原 虫体内细胞膜外, 还会作用于其线粒体[ 29] . 青蒿素 治疗猴疟 2 5 h 后会使寄生虫的线粒体膨胀, 但不 影响 未 感染 的 宿 主 细 胞[ 31] . 二 氢 乳 清 酸 脱氢 酶 ( DH OD) 是线粒体电子转移链反 应的主要电子源, 而青蒿素能够抑制疟原虫 DH OD 的活性[ 32] . 根据 这些研究初步推断疟原虫线粒体可能是青蒿素类衍 [ 33] 生物潜在的作用靶位. 最新研究 揭示青蒿素通过 降低疟原虫 线粒体的 膜电位 使其线 粒体的 功能失 常. 研究人员认为青蒿素与疟原虫线粒体作用的步 骤是: 首先电子转移链激活青蒿素的活性, 产生活 性氧. 反过 来, 产 物活性 氧又破 坏了 线粒 体的功 能. 当线粒 体的活动被 阻止后, 影响嘧 啶和 AT P 的合成, 使疟原虫代谢紊乱而死亡. 2. 3 烷基化作用 烷基化作用是目前大多数学者最支持、研究也 最深入的青蒿素抗疟机制. 2. 3. 1 烷基化血红素 血红素 ( heme) 不仅是青蒿 素类衍生物的还原裂解催化剂, 而且是烷基化的重 要靶点. 1 H NM R 检测到金属卟啉 Mn( ) T P P 与青 蒿素体外反应生成的络合物 [ 34] . 患疟疾的老鼠服用 [ 35] 青蒿素后, 其脾内含有药 物与 heme 的复 合物 , 而健康的老鼠用药后却观察不到两者的复合物. 该 第 19 卷 第1期 2009 年 1 月 29 项研究 说 明 在 生 物体 内 青 蒿 素 同 样 可 以 烷 基 化 素类衍生物的蛋白质靶点, 可能的靶蛋白有以下 4 个. heme. 血红素与青蒿素形成络合物是通过碳自由基 中间体作用的[ 36] , 这支持了血红素介导的两步抗疟 2. 4. 1 作用学说. 第一步, 血红素的亚铁离子诱导青蒿素生 成碳自由基中间体; 第二步, 碳自由基烷基化 heme. 上述实验只能说明青蒿素类衍生物具有烷基化 heme 的性质, 下面的研究工作则表明烷基化能力决 定了这类化合物的生物活性. 研究合成的 1, 2, 4 三 烷衍生物与 Mn( ) T PP 的反应, 发现有活性的化 合物能形成卟啉环复合物, 没有活性的化合物则不反 应[ 37] ; 尽管一些青蒿素衍生物与 Mn( ) T PP 反应时 可以产生碳自由基, 但不能与之发生烷基化, 体外活 性实验证实这些化合物无抗疟作用[ 38] . 由此可见, 烷基化 heme 是该类化合物具有抗疟作用的一个重要 因子. 用光谱测定一系列 9 位 C 取代( 图 1) 青蒿素类 似物与 heme 之间的亲和力, 通过分析发现其与抗疟 [ 39] 活性之间具有明显的相关性 , 亲和力的大小能较 好地反映抗疟活性的强弱. 科学家们基于烷基化机理 设计的新化合物Trioxaquines 是目前最有望成为抗疟 药的青蒿素衍生物[ 40] . 可见, 烷基化机理对于设计 新的抗疟药物具有重要的指导意义. 特异性地抑制 pfATP6 酶 毒胡萝卜素是肌 浆内质网膜钙离子 AT P 酶( SERCA) 的特异性抑制 剂. 青蒿素与毒胡萝卜素的结构相似, 研究人员据 此假 设 青 蒿 素 也 能 特 异 性 地 抑 制 SERCA [ 47] . P fAT P6 是疟原虫体内唯一 的 SERCA 型钙离子调 节酶. 它的作用是调节虫体内的 Ca 2+ 浓度. 当它停 2+ 止工作时, 可以导致细胞内 Ca 大量聚积. 钙超载 激活磷脂酶, 磷脂分解, 造成线粒体氧化磷酸化作 用减弱或停止, 由此产生一系列级联反应, 细胞也 随之凋亡. 在爪蟾的卵母细胞内表达 pfAT P6, 然 后分别 测定 氯喹、奎宁 和青 蒿 素对 pf AT P 6 的影 响, 结果显示 只有青蒿素抑制 了 pf AT P6 的活性. 为了证实青蒿素直接与 pfA T P6 作用, 研究人员将 BODIPY 标记的 毒胡萝卜素加入培养 的寄生虫内, 然后分别与未标记的青蒿素和奎宁共同培养, 显微 镜下观察青蒿素能降低荧光强度, 奎宁则不影响. 这进一步证明了青蒿素与毒胡萝卜素作用于同一靶 点. 比较青蒿 素及其衍生物抑 制 pf AT P6 的能力, 发现青蒿素类衍生物的抗疟 IC50 与抑制 pfAT P6 的 能力之间存在着显著的相关性. 根据以上实验可以 2. 3. 2 烷基化谷胱甘肽 疟原虫在酸性食物泡内降 解血红蛋白时产生大量的过氧化剂和自由基, 降解产 推断出青蒿素特异性结合 pfAT P6. 临床使用的抗 疟药 RBX11160( OZ277) 是全合成的青蒿素衍生物, 物血红素也是活性氧的重要来源, 这很容易导致虫体 遭受氧化应激. 而寄生虫体内含有丰富的还原性谷胱 它与 pfA T P6 的 作用模 式与青 蒿素 相同 [ 48] . 表明 pfAT P6 是青蒿素类化合物共同的靶点. 甘肽. GSH 参与许多生物代谢, 包括清除细胞质中 当 pfA T P6 第 263 位的亮氨酸被谷氨酸、门冬 [ 41] [ 42] 的过氧化物和解毒血红素 . 实验表明 , 疟原虫 体内游离的血红素只有 30% 转变为疟色素, 其余的 氨酸或赖氨酸替代后, 恶性疟原虫对青蒿素的敏感 性降低 [ 49] . 当 pf AT P 6 的第 769 位的丝氨酸突变为 非聚合血红素被 GSH 降解. 在 GSH 或 GSH 浓度高 的情况下, 寄生虫体内不会残留毒性的血红素[ 43] . 天冬酰胺, 蒿甲醚作用于虫体的 IC 50 值升高 . 基 因水平上的研究结论支持 pf AT P6 是青蒿素作用于 因此, GSH 对于寄生虫的存活具有关键作用. 在少 疟原虫的靶点之一. 量的 Fe( / ) 催化下, 青蒿素与 GSH 形成复合物. 吴毓林等[ 44] 已分离出了两者的复合物. 鉴于 GSH 在 2. 4. 2 寄生虫体内的重要性, 该研究有助于重新认识青蒿素 类衍生物的抗疟机制. 2. 4 与疟原虫的蛋白质作用 [ 17] 结合翻译控制肿瘤蛋白( pfTCTP) 将 10 位 3 [ H ] 双氢青 蒿 素与 被感 染 的红 细胞 作 用, SDS P AGE 识别出大小为 25 ku 的蛋白, 根据胶显影可 以认定是疟原虫 的 T CT P ( tanslat ionally contro lled t umor pr ot ein) 蛋白. 在血红素催化下, pfT CT P 与 [ 50] 除了上述抗疟机制外, 青蒿素类衍生物的活性中 间体还能与疟原虫体内的蛋白质作用, 使其失活而产 双氢青蒿素在体内、体外都能共价结合 . 两者间 的结合似乎是特异性的, 因为双氢青蒿素与其他蛋 生抗疟活性. 青蒿素类衍生物与蛋白质的作用已被许 多研究所证实[ 45, 46] . 后期的研究主要集中在寻找青蒿 白的反应相对较慢. T CT P 可能是青蒿素类药物作 用的又一个靶点. 但 T CT P 在寄生虫体内的功能尚 第 19 卷 30 不清楚, 而且目前没有直接的证据支持药物烷基化 T CT P 可杀死疟原虫. 2. 4. 3 抑制半 胱氨 酸蛋 白酶 半胱 氨酸 蛋白 酶 ( Falcipains) 广泛 存在于包括 寄生虫在 内的生物 体 中. 它在疟原虫体内的主要功能是水解蛋白质 [ 41] . 疟原虫体 内的半胱 氨酸蛋 白酶属 于木瓜 蛋白酶 家 族, 有 4 个成员, 其中 F alcipain 2 的贡献占全部半 胱氨酸蛋白酶活性的 93% , 实验证明它能迅速水解 [ 51] 球蛋白残基 . 敲除疟原虫体内的 F alcipain 2, 或 降低 F alcipain 2 的活性, 但保持体内其他的半胱氨 酸蛋白酶与野生型相同. 疟原虫对半胱氨酸蛋白酶 抑制 剂 E64 的 敏 感 性增 强 了 3 倍 [ 52] , 再 次 证 明 Falcipain 2的关键性作用. 纯化鼠疟的消化泡, 加入青蒿素培养, 发现青 蒿素抑制水解酶的活性[ 53] . 疟原虫食物泡的水解酶 有两种: 天冬氨酸酶和半胱氨酸蛋白酶. 疟原虫首 先利用天冬氨酸酶使宿主血红蛋白变性, 再利用半 胱氨酸蛋白酶对变性的血红蛋白进行裂解[ 54] . 当抑 肽素 A( 天冬氨酸酶抑制剂) 和 E64 同时加入消化泡 中, 抑肽素 A 抑制了 70% 的天 冬氨酸酶活性, 剩 下 29% 的半胱氨酸蛋白酶活性被 E64 抑制. 青蒿素 抑制水解酶的比重与 E64 相似. 先加入 E64 作用后 再加入青蒿素, 则没有提高水解酶的抑制程度. 另 外, 抑肽素 A 和青蒿素同时作用也能完全抑制所有 水解酶的活性. 上述实验表明青蒿素可能抑制半胱 氨酸蛋白酶的 活性, 主要 营养 和氨基 酸来 源被 阻 断, 导致虫体缺乏营养死亡, 从而治疗疟疾. 2. 4. 4 络合 pfHRP 第1期 3 2009 年 1 月 结语 综上所述, 青蒿素类衍生物的抗疟机制极其复 杂, 很可能是多途径、多靶点的抗疟作用. 有人提 出该类药物 的神经毒 性机制 也许与 其抗疟 机制一 致 [ 58] . 因而, 阐明青蒿素类衍生物的抗疟机制甚至 对毒性作用的认识也有指导和帮助. 尽管青蒿素类药物已经大量投入临床使用治疗 疟疾, 但就目前的研究现状而言, 许多问题还有待 于进一步探讨和解决. 例如, 利用体外模型研究抗 疟机制时不同的实验条件和实验方法得到的结果不 一致, 甚至 相互矛 盾, 以 至于无 法建 立确 切的机 理. 因而今后应当着手构建与疟原虫体内环境更接 近的模型. 另外, 一些研究提出了几个可能的青蒿 素作用靶点, 但大部分停留在推测阶段, 缺乏可靠 的证据, 对可能的靶蛋白功能研究较少. 在此基础 上, 今后将在以下几个方面展开研究: ( 1) 鉴于实验研究疟原虫蛋白和青蒿素的作用比 较困难, 可以利用量子化学和分子对接法等理论手段, 分别将青蒿素和上述 4 个可能靶蛋白做对接研究, 根 据结合部位和结合强度, 从中比较分析最有可能的分 子靶点, 为基于靶点的药物分子设计提供理论依据. ( 2) 疟原虫的基因组序列测定已经完成, 利用 生物信息学的方法进行序列比对、结构与功能分析 来发掘青蒿素的分子靶. 由于青蒿素选择性杀死侵 入人体的疟原虫, 而对正常 的宿主红细胞不影响, 同样比对疟原虫与人类的基因组序列, 这也许可以 解释青蒿素选择性抗疟的原因. 免疫反应发现纯化的消化泡 参 内含有组氨酸蛋白 ( HRP ) . 据报道, HRPII 被寄 生虫分泌到宿主的红细胞溶质内. 血红蛋白水解后, HRP 与释放的血红素结合, 调控疟色素的形成, 使 [ 55] 泡内 的血红素 聚集 . 电子吸收、共 振 Raman 和 EPR 证实 pfHRP 与血红素形成络合物[ 56] . 当药物 青蒿素与血红素结合成共价复合物后, 在低 pH 条件 下仍能络合 pfH RP [ 57] . 这种亲和力较强的结合也许 1 考 文 献 Liu JM , N i M Y , Fan JF, et al. Th e s t ruct ure an d react ion of Q inghaosu. Chin ese S ci Bull, 1979, 37: 129 2 141 H an LP, Qu LB, Liu T W, et al. Comparat ive invest igat ion of Q H S and DQ H S w it h d ensit y fu nct ional t h eory. Chinese J St ru c Chem, 2005, 24( 5) : 531 3 536 G oldberg D E, Sl at er A FG , Ceram i A , et al. H emoglobin degra dat ion in t he malaria parasit e Pl asmod i um f al cip ar um: An 会干扰血红素的聚集, 使游离的血红素增多而毒死疟 ordered process in a unique organel le. 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