2010级硕士研究生心血管生理学课件(第三次课).pdf
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低氧性动物、器官和细胞模型 生理学教研室 郭海涛 3,700,000 94,945 定义 低氧：当组织得不到充足的氧，或不能 充分利用氧时，组织的代谢、机能、甚 至形态结构都可能发生异常变化，这一 病理过程称为低氧。 研究低氧的意义 • 缺氧是许多疾病所共有的一个基本病理 过程。 • 影响神经、循环、呼吸等系统，造成各 种疾病 。 研究低氧的意义 • 军事医学中也是个非常重要的课题 。 研究方法 • 整体水平 • 器官水平 • 细胞水平 低氧性肺动脉高压 肺动脉高压 • 指各种原因所引起的肺动脉压力持久性增 高，超过正常最高值时即为肺动脉高压。 • 静息时，右心导管测得的平均肺动脉压超 过 25 mmHg ， 而 肺 毛 细 血 管 压 低 于 15 mmHg时称为肺动脉高压。 • 其主要病理生理学特征是肺血管阻力进行 性升高，并逐渐引起右心衰竭。 病理生理学 一、肺动脉高压对肺功能的影响 • 增强肺通气 • 减少肺内生理性死腔样通气 • 增加病理性分流 病理生理学 二、肺动脉高压对心功能的影响 • 右心肥大和衰竭 • 左心衰竭 低氧性肺动脉高压模型 实验动物 低氧性肺动脉高压模型 ¾急性 ¾慢性 • 连续低氧： 高原缺氧 模拟高原缺氧 • 间断性低氧：常压、低压 • 间歇性低氧： 间断性低氧 • 常压 符合由呼吸系统或心血管疾病引起缺 氧，导致的肺动脉高压 钠石灰 常压低氧舱 测氧仪 氮气 间断性低氧 • 常压高二氧化碳 慢性阻塞性肺疾病等气流受限的呼吸系 统疾病并发肺动脉高压 钠石灰 常压低氧舱 氮气 测氧仪 O2 8.5～ 11％ CO2 5.5 ～6.5％ 间断性低氧 • 低压 更接近于高原缺氧 显示系统 控制电路 传感电路 接 触 器 真空泵 缓冲舱 电磁阀 干燥塔 空气走向 低压低氧装置示意图 低压低氧舱 低压低氧装置 间歇性低氧 呼吸睡眠暂停综合症 间歇性低氧 低氧舱 测氧仪 间歇性低氧装置示意图 氮气 氧气 缺点 • 耗气量大 • 实验室空气污染 • 进出气量大，干扰动物活动 间歇性低氧 动物舱 低氧舱 间歇性低氧装置示意图 肺动脉高压检测 检测指标 大鼠肺血流动力学指标 • 平均肺动脉压（mPAP）及右心室压力（RVP）： 右侧颈外静脉→上腔静脉→右心房→三尖瓣口→ 右心室→肺动脉干 • 平均颈总动脉压（mCAP）：左侧颈总动脉插管 • 心电图（ECG）和心率（HR） 超声 • 心脏：三尖瓣反流 • 肺动脉：内径及血流频谱 检测指标 右心室肥厚指标（重量指数）的测定 • 剪去大鼠心脏的心房组织 • 沿室间隔边缘分离出右心室（RV）和左心室＋室 间隔（LV＋S） • 称重 • RV/（LV+S）比值和RV/BW比值 检测指标 肺血管病理检测 • HE染色及弹力纤维染色 • 与呼吸性细支气管及肺泡管伴行的肺小动脉（直 径小于100μm）的外径（ED）、动脉中层壁厚 （MT ）、管壁中层横截面积（MA）、血管管腔 横截面积（VA）和血管总横截面积（TAA） • 计算血管壁中层厚度占外径的百分比（MT%）， 血管壁中层横截面积占血管总横截面积的百分比 （MA% ） • 反映肺小血管管壁增厚程度 • 弹力纤维+Van Gieson (VG)染色 • 网格目镜、高倍视野 • 肺腺泡内小动脉计数：无肌型、部分肌型和肌型 检测指标 透射电子显微镜观察 • 肺门处取1 mm3肺组织 • 2.5%戊二醛固定、包埋后超薄切片 • 透射电子显微镜观察肺小动脉内皮细胞、平滑肌 细胞的超微结构改变 检测结果 表1 不同时间的慢性低氧对大鼠肺血流动力学指标的影响 Table 1 Changes in hemodynamics in rats exposed to chronic hypoxia Group mPAP(mmHg) RVP(mmHg) mCAP(mmHg) HR(beats/min) Control 15.2±2.3 25.6±1.7 113.1±8.2 368±18 1w hypoxia 25.5±1.8b 34.8±2.1b 110.8±7.3 377±10 2w hypoxia 27.9±2.2b 35.6±1.7b 111.3±8.10 378±14 4w hypoxia 32±3.3b 36.8±2.0b 111.4±8.0 375±9 n=8, bP<0.01 vs control. mPAP: mean pulmonary artery pressure; RVP: right ventricular pressure; mCAP: mean carotid artery pressure; HR: heart rate; 1 mmHg = 0.133 kPa. 表2 不同时间的慢性低氧对大鼠肺血管重建及右心室肥厚指标的影响 Table 2 Changes in pulmonary artery remodeling and right ventricular hypertrophy in rats exposed to chronic hypoxia Group MT％ MA% RV/(LV+S) RV/BW(mg/g) Control 9.6±1.9 25.5±3.5 0.26±0.04 0.58±0.06 1w hypoxia 16.2±2.6b 36.2±4.0b 0.30±0.04 0.65±0.07 2w hypoxia 21.3±2.5 b,d 48.9±4.2b,d 0.38±0.06 b,d 0.90±0.06 b,d 4w hypoxia 25.5±2.8 b,d,f 55.6±5.6 b,d,e 0.41±0.07 b,d,f 0.99±0.08 b,d,f n=8, bP<0.01 vs control, dP<0.01 vs hypoxia 1w group, eP<0.05 vs 2w hypoxia group, fP<0.01 vs 2w hypoxia group. MT:medial wall thickness;MA:media cross-sectional area;RV: right ventricule; LV:left ventricule; S:septum; BW:body weight; 1 mmHg = 0.133 kPa. A B C D 图3 大鼠肺小动脉HE染色（×400） A:对照组; B: 低氧1w组; C:低氧2w组; D:低氧4w组. A B C D 图4 大鼠肺小动脉弹力纤维染色（×400） A:对照组; B: 低氧1w组; C:低氧2w组; D:低氧4w组. • 肌型动脉：全层性增生 • 部分和无肌型动脉：平滑肌细胞增生 • 肌型动脉：数量增多 透射电子显微镜 • 内皮细胞：肿胀，饮泡增多，核膜增厚； 基底膜缺失 • 肌纤维母细胞：线粒体及粗面内质网多 缺氧性肺血管 肺动脉环的制备 • 麻醉 • 取出气管主干、肺和心脏 • 分离肺动脉：右心室→肺动脉主干→二 级～三级分支（直径约1～1.5 mm）→截 成长约3 mm的血管环 肺动脉环的制备 • 血管环悬挂 • 血管环基础张力 • 平衡 • 记录血管环张力 血管灌流装置示意图 肺血管环活性检测 • 平滑肌活性：1 μmol/L苯肾上腺素，> 300 mg→活性好 • 血管内皮完整性：1 μmol/L乙酰胆碱，>80 %→内皮完整 •急性低氧：95%N2+5%CO2，60 min 急性缺氧性肺血管收缩示意图 •慢性低氧：低氧模型，取肺血管 缺氧性肺血管收缩示意图 注意事项 • Krebs-Henseleit液必须临用时用新鲜蒸馏 水配制。 • 肺组织内气管、静脉和动脉均属于树杈型分 布，终末分支交错贯通，分支较多后，镜下 观察不易区分，必须有主干作为区别的标 识；分离动脉时切忌用力牵拉，以免损伤血 管活性；悬挂血管环时避免接触血管内壁， 以免损伤血管内皮。 • 通入混合气体速度应控制好，既不影响血管 张力记录，又要达到有效的缺氧条件。 细胞低氧模型 • 低氧动物模型 • 细胞直接低氧 细胞低氧方法 • 环境性低氧 • 低糖、无血清培养（灌流）液 • 与空气隔绝 • 中断呼吸链 三气培养箱 优点：根据实验要求调整O2浓度；可以快 速复氧。 缺点：价格昂贵；使用频率较低；同一时 间，氧气浓度相同。 自制的低氧盒（罐） 自制的低氧盒（罐） 3倍体积 95％ N2和5％ CO2 间歇性低氧 • 编写程序：间歇低氧／正常氧循环次数 及循环时间 • 细胞培养舱：气体氧浓度监测器、气体 二氧化碳浓度监测器 • 优点：易于控制低氧程度。 • 缺点：膜片钳以及动缘细胞探测等系统， 此方法显然无法实现正常操作 。 细胞低氧方法 • 环境性低氧 • 低糖、无血清培养（灌流）液 • 与空气隔绝 • 中断呼吸链 • 无血清培养基 • 低糖培养基（葡萄糖500，常规培养基为 2250），此法常用于制造培养的神经细胞 缺氧模型。 • 低氧、无糖、高乳酸和酸中毒综合方式 细胞低氧方法 • 环境性低氧 • 低糖、无血清培养（灌流）液 • 与空气隔绝 • 中断呼吸链 N2 细胞低氧方法 • 环境性低氧 • 低糖、无血清培养（灌流）液 • 与空气隔绝 • 中断呼吸链 • 氰化物、硫化氢、磷 、硫化氢、砷化物等 • 细菌毒素、放射线 与氧化型细胞色素氧化酶的Fe3+结合, 使细胞色素失去传递电子能力, 结果使呼吸链中断 图 低氧对肺血管平滑肌细胞增殖的影响 **P<0.01 vs control Thank You!