病毒的分离培养.pdf
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病毒的分离培养鉴定和血清 学检测 一 病毒的鸡胚接种法 病毒需严格细胞内寄生，培养病毒必须在 活的动物、鸡胚或细胞内进行。新城疫病 毒（NDV）、流感病毒（IFV）等对鸡胚培 养敏感，因此常用鸡胚接种法分离培养 NDV、IFV等。目前对IFV的疫苗制备就是 在鸡胚培养中进行的。由于NDV、IFV在鸡 胚内培养时并不引起明显的鸡胚病变或死 亡，常用血凝和血凝抑制试验对病毒进行 鉴定。 （一）接种方法 1）孵育9~11天左右的鸡胚，在照蛋灯下用 蜡笔标出气室和胎位； 2）鸡胚直立于蛋盘上，气室端向上，按常规 以碘酒，酒精消毒； 3）在避开鸡头和大血管的位置，用磨蛋器在 气室中央磨一小孔，再用碘酒擦拭消毒； 4）用1ml注射器吸取NDV悬液，针头从气室 小孔刺入（沿胚胎的长轴刺入）0.5--1cm 深度；此时针头已在尿囊腔中，注入0.2ml 病毒悬液； 5）拔出针头，用镊子将小胶布蘸取酒精烧灼 后封闭小孔，置于35~36℃温箱内培养，其 中翻动两次，用照蛋灯检视一次，36小时 后置-20℃冰箱20分钟后，无菌操作收获尿 囊液。 鸡 胚 的 检 卵 （二） 尿囊液的收获 1）从冰箱中取出鸡胚，用碘酒、酒精消毒气 室部位； 2）用无菌镊子除去胶布并去除气室部分的卵 壳； 3）用无菌的毛细吸管插入尿囊腔中轻轻吸取 尿囊液(避免血管破裂)，置于无菌中号试管 中； 4）获得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑制 试验（定性），判断病毒的增殖情况并对 病毒进行鉴定；同时做无菌实验。 （三） 血凝和血凝抑制实验 某些病毒包膜表面的血凝素（HA）能与人 “O”型红细胞、脊椎动物如豚鼠、鸡等的 红细胞上的血凝素受体结合，引起红细胞 凝集。在病毒悬液中加入相应的特异性抗 血清后，由于相应的抗体与HA结合，使其 失去凝集作用，再加入人的“O”型血、鸡 或豚鼠的红细胞则不再发生血凝现象，即 为血凝抑制。上述两种现象可作为判断病 毒存在的指标及鉴定病毒。 1.血凝实验： ①取U型孔有机玻璃板一块，按顺序编号； ②于第1孔加入生理盐水0.9ml，余孔各加0.5ml； ③于第1孔加收获的尿囊液0.1 ml； ④另取一支吸管将第1孔混匀后吸取0.5ml至第2孔； 再将第2孔混匀后吸0.5 ml 至第3孔，以次类推， 直至第8孔，从第8孔中吸取0.5 ml 弃去。第9孔 不含病毒，为红细胞对照孔。每孔加入1％鸡血 球0.25ml。 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 生理盐 水(ml) 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 病毒液 (ml) 0.1 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃 0.5 1： 10 1： 1： 20 40 1： 1： 80 160 1： 320 1： 640 1： 1280 — 病毒液 稀释度 1%鸡红 细胞(ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 立即摇匀，置室温30~45分钟后观察结果。 注：弃去的液体及吸管一起放入盐酸桶中消毒 [结果判断] “+”号多少表示血凝程度： “++++” 100％的RBC发生血凝，形成花边拉 网状； “+++” 75％的RBC发生血凝血凝效价 的判断； “++” 50％的RBC发生血凝； “+” 25％的RBC发生血凝；“-” 100％的RBC沉积。 血凝效价以出现“2＋”为终点，即50％的 RBC发生血凝的最高稀释倍数为病毒的血凝效 价。 2.病毒血凝抑制实验（定性）： ①根据血凝试验滴定的NDV血凝效价，先将病毒液 配成4个血凝单位。做此血凝抑制实验时，应在 0.25ml病毒液中含4个血凝单位。如血凝效价为1： 320，只需稀释80倍即为4个单位； ②在U型孔有机玻璃板上选4个孔，按下表操作： 血凝抑制试验(定性法) 孔号（ml） 1 2 3 4 生理盐水 (ml) — 0.25 0.25 0.5 血清(ml) 0.25 0.25 — — 病毒液(ml) 0.25 — 0.25 — 1%鸡红细 胞(ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 说明：1号孔为试验孔，2号孔为血清对照孔， 3号孔为病毒对照孔，4号孔为红细胞对照 孔。将各孔内容摇匀，室温静置45min，待 红细胞完全下沉后观察结果。 结果判断: 凡出现明显血凝现象者，为血凝 抑制试验阴性。而未出现血凝的试验孔， 以阳性表示，说明病毒与该孔所用诊断血 清的型与亚型相一致。 二、病毒的细胞接种法与培养 （一）细胞制备的操作步骤 1）在DMEM和Hank’s 液中以1％的量加入双抗； 2）取出两只无菌平皿，待用； 3）碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚气室外卵壳； 4）大镊子轻敲卵壳顶部然后小心去掉气室外卵壳； 5）用无菌镊子小心撕破卵膜，取出鸡胚置于盛有 Hank’s 液的平皿中。小心去头、内脏、爪，洗涤 后置于盛有Hank’s 液的平皿中，再充分洗涤2次； 6）取出洗净的组织块置于青霉素瓶中，用无 菌眼科剪刀将其剪成约0.5～1mm3的小块 （约250次）此时体积约0.5ml；用Hank’s 液洗涤两次； 7）加入1.0％胰酶，配成终浓度为0.25%， 并调节pH至约7.6～8.0（肉眼观为肉红 色）。盖上瓶塞，写好标记； 8）将上述青霉素瓶置于37℃水浴中约15～ 30min，其间缓慢摇匀以充分消化； 9）消化结束后，稍沉淀，缓慢吸出上清，用 Hank’s 液小心洗涤沉淀2～3次，尽量减少 胰酶的残留量，然后加入DMEM液约5ml， 吸管充分吹打，使细胞充分分散。吸上清； 重复操作3～4次，收集细胞上清，并加入 足量的小牛血清（终浓度为10％）； 10）将上述制备好的细胞悬液移至细胞瓶中， 5ml/瓶。 细胞消化后轻轻摇晃， 呈云雾状，表示消化良 好。 （二）滤泡性口炎病毒（VSV）的接种培养 1）一瓶细胞接种病毒0.1ml，另一瓶细胞作为正常 对照，做好标记，统一置于CO2孵箱中恒温培养 36 h后，观察结果； 2）鸡胚原代成纤维细胞的显微镜下观察：36 h后 观察细胞生长情况，细胞长成单层，细胞界限清 晰、透明，大多数细胞为梭形并贴壁，布满细胞 瓶的生长面，说明细胞生长状态良好。接种VSV 的鸡胚原代成纤维细胞，细胞病变效应（CPE） 的观察：培养36 h后，显微镜下观察，可见细胞 出现明显的病变，细胞圆缩、脱落、溶解。 三、可疑流感患者血清血凝抑制 抗体检测 • 原理： • 流感病毒（IFV）包膜表面有血凝素 （HA），感染后能刺激机体产生相应的 抗体，该抗体与HA结合后，使其失去凝 集作用，再加入人的“O”型血、鸡或豚鼠 的红细胞则不再发生血凝现象，即为血凝 抑制，可通过定量血凝抑制试验测定患者 血清中有无相应抗体及其效价。但需取双 份血清作两次试验，若恢复期血清抗体效 价比早期高4倍或4倍以上，即有诊断意义。 ①取一块U型有机玻璃板，选10个孔，按下表所示 加样，第1孔加入0.4ml生理盐水，第2至9孔每孔 加入0.25ml生理盐水，第10孔加0.5ml； ②取经处理的1∶4稀释的病人血清0.1ml，加入第 一孔内作1∶20稀释，抽吸3次，混匀后取0.25ml 加至第2孔，依次类推作倍比稀释至第7孔，混匀 后从第7孔吸出0.25ml弃去。第8孔为血清对照， 加入1∶4稀释的血清0.25ml；第9孔为病毒对照、 第10孔为红细胞对照，均不加血清； ③1～7孔和9孔，每孔加入含4个血凝单位的IFV悬 液0.25ml；第8孔血清对照与第10孔红细胞对照 则不加IFV悬液； ④每孔加入1%鸡红细胞0.25ml，摇匀后置室温 30min、45min各观察一次结果，以45min的结 果为准(如果红细胞滑下，参考30min的结果)。 流感病毒血凝抑制试验(定量) 孔 号 1 生理 盐水 (ml) 0.4 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.5 血清 (ml) 0.1 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 4u IFV (ml) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 2 3 4 5 6 7 8 血清 对照 - 9 10红 病毒 细胞 对照 对照 - - 0.25 - 1% 鸡红 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 细胞 (ml) • 结果判断 • 血凝抑制试验的结果判断同血凝试验，但 是以不出现血凝现象的试验孔为阳性。先 观察对照孔，如果病毒对照孔出现完全凝 集、血清对照和红细胞对照不发生凝集， 再观察试验孔，判断效价。凡呈现能完全 抑制凝集的试验孔，其血清的最高稀释度 即为血凝抑制效价。根据血清中血凝抑制 效价的增长情况，以升高4倍或4倍以上为 感染。 • （四）作业 撰写实验小论文1篇。 • （五）思考题 1．简述病毒鸡胚接种法的基本过程。 2．简述鸡胚原代成纤维细胞制备的主要步骤。