跨膜蛋白受体在LRRC19调节机体先天免疫应答反应中的作用.pdf
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36 解放军医学杂志 2010 年 1 月 1 日 第 35 卷 第 1 期 M ed J C hin PL A, V ol 35, N o 1, J anu ary 1, 2010 跨膜蛋白受体在 LRRC19 调节机体先天免疫应答反应中的作用 柴立民, 车永哲, 杨荣存 [ 摘要] 目的 确定已初步鉴定的富亮氨酸重复结构 ( L RR) 蛋白家族成员 L RRC19 在脾细胞中的表达及定位, 并对其功能进 行初步研究。方法 通过生物信息学技术预测 LRRC19 蛋白结构; mRNA 原位杂交和 RT PCR 检测 LRRC19 mRN A 在小鼠脾组织 以及不同脾细胞中的表达; 以不同细菌刺激 LRRC19 转染的 293T 细胞, 通过分泌性碱性磷酸酶 ( SEAP) 检测技术观察细胞分泌的 NF B 活性的改变。结果 L RRC19 是一种跨膜蛋白, 属于 LRR 蛋白家族成员, 胞外区存在串联排列的 4 个 L RR 基序, 有单一的跨 膜结构域, 胞内区有 2 个酪蛋白激酶 2 ( CK2) 磷酸化位点; mRNA 原位杂交和 RT PCR 结果显示, LRRC19 mRNA 在脾脏主要表达于 B1 淋巴细胞; 体外实验证实, 多种细菌均可使转染 LRRC19 的细胞 NF B 活性增强。结论 L RRC19 可能是一种跨膜受体, 可识别 不同的病原体保守分子, 可能参与介导细胞信号转导, 激活 NF B 信号途径, 启动靶基因转录, 调节先天免疫应答过程。 [ 关键词] LRRC19 蛋白, 人; B 淋巴细胞; NF B [ 中图分类号] R392.11 [ 文献标志码] A [ 文章编号] 0577 7402( 2010) 01 0036 04 LRRC19, as a transmembrane protein receptor, modultes innate immune response CHAI Li min, CH E Rong zhe, YANG Rong cun* Department of Immunology, School of Medicine, Nankai University, T ianjin 300071, China * Corresponding aut hor, E mail: ryang@ nankai edu cn [ Abstract] Objective To study an identified leucine rich repeats ( LRRs) protein, LRR containing 19 ( LRRC19) , and to determine the distribution, localization, and biolog ical function of LRRC19 mRN A ex pression in spleen cells. Methods Bioinformatics analysis was used to predetermine the structure of LRRC19 gene and protein. T he distribution and localization of LRRC19 mRNA ex pression were detected by hybridization in situ with LRRC19 mRNA specific probes and reverse transcriptase polymerase chain reaction ( RT PCR) . Additionally, the activity of secreted alkaline phosphatase ( SEAP ) was detected for analyzing the nuclear factor kappa B ( NF B) activation in HEK293T cells transfected w ith the ex pression vector of L RRC19 in vitr o. Results LRRC19 was found to be a transmembrane protein, with 4 LRR motifs, a sing le transmembrane domain and two phosphorylation sites of casein kinase 2 ( CK2) at cytoplasmic domain, as analyzed through bioinformatics soft wares. Previous study revealed that L RRC19 w ithout cytoplasmic Toll/ IL 1 receptor ( T IR) domain could activate NF B to enhance the expression of proinflammatory cytokines. LRRC 19 could also be demonstrated by ectopic expression in RAW 264 7 cells after transfection with murine LRRC19 ex pression plasmid pcDNA3 1 V5 LRRC19 indicating that it was a transmembrane protein. In persent study, the results of hybridization in situ and RT PCR showed that L RRC19 mRN A was expressed in the germinal center and splenic cord of mouse spleen. Additionally, LRRC19 was predominantly expressed in CD5+ lymphocyte, known as B1 cell. I n vitro study also indicated that several pathog ens mig ht sig nificantly enhance the NF B activity of the cells transfected with LRRC19. Conclusion LRRC19 might be a transmembrane receptor, and it may be able to recognize the conserved sequence of pathogens, participate in the induction of cell signaling, activate the NF B signal pathway, promote transcription of target genes, and modulate the innate immune response. [ Key words] L RRC19 protein, human; B lymphocytes; NF kappa B 富亮氨酸重复结构( leucine rich repeats, LRRs) 是 介导蛋白与蛋白间相互作用的高度保守的氨基酸序 列。晶体结构分析显示, 每一个独立的亮氨酸重复构 成一个独立的 单位, 由一个短的 折叠和一个 螺 旋组成, 两者近乎平行排列。另外, 每个连续重复的 [ 基金项目] 国家自然科学基金( 30771967, 30872315) ; 国家科技部基金 ( 06C26211200695, 2008A A02Z129) ; 国家高技 术研究发展计划( 863 计划, 2006AA020502) ; 天津市科委基金( 07JCZDJC03300, 06ZHCXSH04800) [ 作者简介] 柴立民, 医学博士, 助理研究员, 南开大学医学院在站博士 后。主要从事免疫抑制细胞新功能 基因方面的研究。E mail: liminchai @ hot mail com [ 作者单位] 300071 LRR 蛋白家族成员 LRRC19, 通过 mRNA 原位杂 交技术观察其在小鼠脾脏细胞中的表达及定位, 并对 其功能进行了初步研究。 1 材料与方法 天津 南开大学医学院分子免疫学实验室( 柴立 民、杨荣存) , 解剖学教研室( 车永哲) [ 通讯作者] 螺旋围绕一个共同的轴, 彼此也近乎平行排列, 构成 一个弯曲的马蹄形结构的外层, 折叠围绕此轴平行排 列。由于 LRR 基序具有这种马蹄形的结构特征, 故容 易与较小的球形蛋白结合, 介导蛋白与蛋白间的相互 作用。LRR 蛋白家族成员广泛存在于细菌、 真菌、 植物 和动物等诸多物种的不同组织中, 参与机体中多种生 物学作用。本研究通过生物信息学分析鉴定了一个 杨荣存, 电话: 022 23509007; E mail: ryang@ nankai edu cn 1 1 实验材料 近交系 C57BL/ 6 雄性小鼠, 6~ 8 周 龄, 购自军事医学科学院动物中心。HEK293T 细胞株 解放军医学杂志 2010 年 1 月 1 日 第 35 卷 第 1 期 M ed J Chin PLA , V ol 35, N o 1, January 1, 2010 为本实验室冻存, 高温高压灭活细菌混悬液购自天津 疾病 预 防 控 制 中 心, pcDNA3 1 V5 LRRC19、pcD NA3 1 V5 LRRC19!( LRRC19 胞内区序列) 由本实验 室构建并保存。分泌型碱性磷酸酶 ( secreted alkaline phosphatase, SEAP) 化学发光 检测试剂盒、pSEAP NF B 报告质粒购自 Clontech 公司, LRRC19 mRNA 多点标记 DIG 探针原位杂交试剂盒购自天津灏洋生物 公司。ant i CD5 PE 抗体、anti CD19 FIT C 抗 体 购自 Sant a Cruz 公司, Trizol 、 脂质体转染试剂 Lipofect amine 2000 购自 Invt rogen 公司。 1 2 实验方法 1 2 1 生物信息学预测 通过 HMMpfam 软件预测 LRRC19 基因的组织分布, LRRC19 蛋白跨膜区利用 TMHMM( version 2 1) 和 HMMTOP( version 2 1) 软件 共同分析, 该蛋白结构域通过 Motif scan 在线软件分析 确定。 1 2 2 小鼠脾脏分离、 固定及脾细胞分选 无菌条件 下取出 C57BL/ 6 小鼠脾脏, 迅速放入 4% 多聚甲醛, 室 温固定 24h 后, 常规脱水、 包埋, 以备进行 mRNA 原位 杂交。另取 3 只小鼠脾脏, 研磨制备脾细胞悬液, 用淋 巴细胞分离液离心获得单核细胞, 0 1mol/ L PBS 漂洗 3 次, 血清封闭 30min, 加入 anti CD19 FITC、anti CD5 PE 抗体混合液, 室温孵育 30min, 0 01mol/ L PBS 漂洗 1 次, FACS Aria 流式 细胞分选 仪 ( BD 公 司) 分选 CD5+ CD19- 、 CD5- CD19+ 和 CD5- CD19- 细胞群。将 分选出的细胞分为两组, 一组细胞直接用 4% 多聚甲醛 固定, 以备 mRNA 原位杂交实验, 另一 组细胞加入 RNA 提取液 Trizol , 以备提取总 RNA。所用试剂均经 过焦炭酸二乙酯 ( DEPC) 处理, 以防止 RNA 在操作过 程中降解。 1 2 3 RT PCR 分析 Trizol 一步法提取脾细胞总 RNA, 经反转录成 cDNA。以 cDNA 为模板, 用小鼠 LRRC19 特异性引物进行 PCR 扩增。扩增条件: 95 ! 预变性 5min; 95 ! 变性 30s, 55! 退 火 30s, 72 ! 延伸 30s, 共 35 个循环; 72 ! 后延伸 5min。以小鼠 GAPDH 作为内参。LRRC19 引物序列: 正义 5∀ AT GAAAGT CACACGCT T CAT GTT T T GGC 3∀, 反 义 5∀ CT T T T C T TCAT GTACCT CAT T GATAT CT 3∀; GAPDH 引 物序 列: 正义 5∀ GT GGCAAAGTGGAGAT T GT T G 3∀, 反义 5∀ CAGT CT T CT GGGT GGCAGT GAT 3∀。1 2% 琼 脂 糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物, UV 凝胶成像系统分 析处理。 1 2 4 mRNA 原 位杂交 以 小鼠 LRRC19 mRNA ( GenBank NM_175305) 序列为模板, 设计地高辛多点标 记的 LRRC19 mRNA 特异性探针, 序列如下。探针 1: 5∀ AGCT GT GGT GCATCGAAGAGGCGTATC 3∀; 探针 2: 5∀ T GATAGCAAT GAAGATAAGCAGT GAAGT T 3∀; 37 探 针 3: 5∀ CAGGCGAT GGT GGTT GTAACT CAGCA G 3∀。3 种探针混合使用。切取 5∀m 脾组织石蜡切片, 按标准操作脱蜡至水, 梯度乙醇复水, 0 01mol/ L PBS 冲洗 2 次; 分选后的细胞直接涂布于多聚赖氨酸处理 的载玻片上。mRNA 原位杂交严格按照试剂盒说明操 作。杂交结束后, 二氨基联苯胺 ( DAB) 染色, 光学显 微镜下观察, 至细胞质阳性染色与细胞外背景染色对 比度反差明显时用蒸馏水冲洗终止反应。细胞质呈现 棕黄色颗粒为阳性反应。染色完成后, 苏木素复染, 胞 核为蓝色。梯度乙醇脱水, 中性树胶封固, 光学显微镜 下成像并分析实验结果。 1 2 5 SEAP 检测 NF B 活性 用 DMEM 高糖培养 基常规培养 H EK293T 细胞, 制备单细胞悬液, 调整细 胞数为 2 # 106 / ml 后接种至 24 孔板( 500∀l/ 孔) , 每组 设 3 个复孔。待细胞贴壁后, 用 pcDNA3 1 V5 LRRC19 或 pcDNA3 1 V5 LRRC19!与 pSEAP NF B 通过 Lipo fect amine 共转染细胞, 以 pcDNA3 1 质粒表达载体作为 阴性对照。转染 24h 后, 吸取细胞上清液 100∀l, 4! 保 存; 同时, 补充细胞培养基至 500∀l, 加入稀释后的灭活大 肠埃希菌( Escherichia coli ) 、痢疾志贺菌( Shigell a dys enteriae) 、 金黄色葡萄球菌( Stap hyl ococcus aureus, SA) 和变形杆菌( Bacil lus p roteus ) 混悬液, 刺激细胞 24h 后, 吸取细胞上清液。按照 SEAP 试剂盒说明操作, 检 测细胞上清液的中 NF B 活性, 通过化学发光免疫分 析仪检测各样本的相对荧光强度( RFU) 。 2 结 果 2 1 LRRC19 基因与蛋白结构分析 生物信息学分析 显示, LRRC19 基因位于人类 9 号染色体 p21 1 区( 图 1A) , 由 5 个外显子组成开放阅读框。蛋白结构预测结 果证实, LRRC19 是作为跨膜蛋白存在的, 由 370 个氨 基酸构成, 胞外区拥有 4 个串联排列的 LRR 基序, 在 起始氨基端由 24 个氨基酸组成可剪切的信号肽, 单一 的跨膜结构域位于 A271- I291( 图 1B) 。成熟的 LR RC19 蛋白由 346 个氨基酸组成, 分子量为 42 33kD。 进一步分析发现, 在 LRRC19 蛋白胞内区存在 2 个潜 在的酪蛋白激酶 2 ( casein kinase 2, CK2) 磷酸化位点。 2 2 LRRR19 mRNA 在小鼠脾脏中的分布及细胞定 位 mRNA 原位杂交结果显示, LRRC19 mRNA 广泛 分布于小鼠脾脏的各个部位, 在脾索和生发中心均有 大量的阳性细胞存在 ( 图 2) 。经流式细胞仪分选获得 CD5+ CD19- 、CD5- CD19+ 和 CD5- CD19- 细 胞 群。 RT PCR 检 测 显 示, LRRC19 mRNA 主 要 在 CD5+ CD19- 细胞表达, 在 CD5- CD19+ 和 CD5- CD19- 细胞 的 RT PCR 产物中未发现目的条带 ( 图 3A) 。mRNA 原位杂交结果显示, CD5+ CD19- 细胞胞质中均呈现棕 黄色, 进一步证实了LRRC19mRNA在该类细胞的表 38 解放军医学杂志 2010 年 1 月 1 日 第 35 卷 第 1 期 M ed J C hin PL A, V ol 35, N o 1, J anu ary 1, 2010 的细胞经诱导后 NF B 活性无明显改变( 图 4) 。 图 3 LRRC mRNA 在不同脾细胞中的表达 A RT PCR 检测 LRRC19 mRN A 在 CD5+ CD19- 、CD5- CD19+ 和 CD5- CD19- 淋巴细胞中的表达情况; B mRN A 原位杂交分析 LR RC19 mRN A 在 CD5+ CD19- 和 CD5- CD19+ 细胞中的表达。1 CD5+ CD19- 淋巴细胞( # 1 000) ; 2 CD5- CD19+ 淋巴细胞( # 1 000) Fig 3 Ex pression of L RRC19 mRNA in different kinds of 图 4 不同灭活菌株对转染各质粒的 293T 细胞分泌的 NF B 活性的影响 1 大肠埃希菌; 2 痢疾志贺菌; 3 金黄色葡萄球菌; 4 变形杆菌 Fig 4 Effects of 293T cells, transfected with ecto pic LRRC19 induced by deactivated strains of bacteria, on NF B activity spleen cells - + 达, 而在 CD5 CD19 细胞中未发现阳性反应 ( 图 3B) 。 2 3 灭活菌株对转染 LRRC19 的 293T 细胞中 NF B 活性的影响 不同灭活菌株均可使转染 pcDNA V5 LRRC19 的 293T 细胞的 NF B 活性显著增强, 而转染 pcDNA3 1 V5 LRRC19! 和 pcDNA3 1 质粒表达载体 3 讨 论 LRR 是一个高度保守的氨基酸序列, 通常由 20~ 29 个氨基酸残基组成, 其中 11 个氨基酸高度保守。蛋 白晶体结构分析显示, LRR 是由一个 片层和一个 [ 1] 螺旋通过 loop 环连接形成的马蹄形分子结构域 。对 39 解放军医学杂志 2010 年 1 月 1 日 第 35 卷 第 1 期 M ed J Chin PLA , V ol 35, N o 1, January 1, 2010 LRR 进行的功能研究发现, 不论位于胞外、 胞内还是细 胞膜上, 许多 LRR 蛋白家族成员均参与机体的固有性 [ 2] 免疫应答反应 。 LRRC19 是我们通过生物信息学技术鉴定的一个 新的 LRR 蛋白家族成员, 属于一种跨膜蛋白, 其胞外 区拥有 4 个串联排列的 LRR 基序, 前期序列对比及进 化树研究证实, LRRC19 胞外区序列与 Toll 蛋白样受 表达于 B1 细胞。B1 细胞属于 T 细胞非依赖性细胞, [6] 可以识别多种病原体, 调节先天免疫应答反应 。LR RC19 具有与 TLRs 相似的胞外区 LRR 结构域和胞内 区潜在的 CK2 磷酸化位点, 可以被多种不同的 T LRs 识别, 激活 NF B 信号通路, 刺激脾脏的 B1 细胞表达 IL 8, 故笔者认为 LRRC19 可能参与机体的先天免疫防 御反应。为了验证这一点, 笔者在体外用多种灭活的 体 ( Toll like receptors, T LRs) 胞外区序列相类似, 且 蛋白质结构具有较强的同源性。TLRs 是存在于生物 体内的一类重要的模式识别受体, 在机体天然免疫反 应中起着重要作用。T LRs 主要识别病原体保守的结 构 分 子 ( pat hogen associat ed molecular patt erns, PAMPs) , 介导细胞内信号传导, 最终导致核转录因子 NF B 活化, 从而启动靶基因表达、 介导机体的炎症应 [ 3] 答 。T LRs 胞外区含有相似的 LRRs 基序, 胞内区存 细菌刺激转染 pcDNA3 1 V5 LRRC19 的 293T 细胞, 结果显示, 不同细菌刺激后, 转染 pcDNA3 1 V5 LR RC19 的细胞 NF B 活性显著增强。由此证实, LR RC19 可以识别多种病原体分子, 激活 NF B 信号通 路, 启动机体的免疫应答。 综上所述, LRRC19 可能是一个新的 LRR 蛋白家 族成员, 是一种跨膜受体, 主要在脾脏中的 B1 淋巴细 胞中表达, 通过识别不同的 PAMPs, 介导细胞信号传 在与 Toll 及 IL 1 同源的 T IR 结构域( Toll / IL 1 recep t or homologous region, T IR) 。不同于 T LRs 的是, LR RC19 在胞内区没有 T IR 结构域, 但存在 2 个 CK2 磷 酸化位点。CK2 是真核生物体内高度保守的丝/ 苏氨 酸四聚体激酶, 它可以通过 Ser536 和 Ser276 位点 p65 的磷酸化介导信号传递, 激活 NF B 信号通路[4] 。笔 者前期研究结果显示, LRRC19 在 RAW264 7 细胞中 导, 激活 NF B 信号途径, 启动靶基因表达, 调节先天 免疫反应。本研究仅对 LRRC19 的组织定位和功能做 了初步探讨, 其在细胞内如何激活 NF B 信号传导途 径及其功能的作用机制, 还有待进一步深入研究证实。 的表达主要集中于细胞膜周围, 提示其为一种跨膜蛋 白, 与生物信息学分析结果一致; 异位表达的 LRRC19 在不同的 T LRs 配体刺激下, 可使细胞内 NF B 活性 显著增强, 炎症因子 IL 8 表达量明显升高[ 5] 。由此笔 者认为, LRRC19 是一个跨膜蛋白受体, 可能通过有别 于 T LRs 的信号传导通路, 在 CK2 磷酸化的协同作用 下激活转录因子 NF B, 启动机体的免疫应答。 mRNA 原位杂交结果显示, LRRC19 mRNA 在小 鼠脾脏中的表达主要集中于生发中心和脾索区域。进 + 一步研究证实, CD5 CD19 脾脏细胞表达 LRRC19, 而 在其他两种细胞( CD5- CD19+ 和 CD5- CD19- ) 中未检 测到 LRRC19 mRNA 的存在。35% 的脾细胞属于 B 淋 巴细胞 ( B 细胞) , 在脾脏中 B 细胞主要集中在生发中 心和白髓的淋巴滤泡。CD5 是 B1 细胞的特异性表面 ∃参考文献% [ 1] Kobe B, Kajava AV motif [ J] [ 2] Kobe B, Kajava AV motif [ J] [ 3] The leucine rich repeat as a protein recognition Curr O pin St ruct Biol, 2001, 11( 6) : 725 732. The leucine rich repeat as a protein recognition Curr O pin St ruct Biol, 2001, 11( 6) : 725 732. Akira S Toll like receptor signaling[ J] J Biol Chem, 2003, 278 ( 40) : 38105 38108. [ 4] Shaul JD, Farina A, Huxf ord T The human IK Kbet a subunit ki nase domain displays CK 2 like phosphorylation specif icity [ J ] Bio chem Biophys Res Commun, 2008, 374( 3) : 592 597. [ 5] Chai L, Dai L, Che Y, et al LRRC19, a novel member of t he leu cine rich repeat protein f amily, act ivat es NF kappaB and induces ex pression of proinf lammat ory cytokines [ J] Biochem Biophys Res Commun, 2009, 388( 3) : 543 548. [ 6] Andersson P, Ridderst ad A, M cGuire J, et al A const it utively ac t ive aryl hydrocarbon recept or causes loss of perit oneal B1 cells [ J] Biochem Biophys Res Commun, 2003, 302( 2) : 336 341. ( 2009 09 28 收稿 2009 11 02 修回) ( 责任编辑 张金桐) 抗原。根据实验结果, 笔者认为 LRRC19 在脾脏主要 读者 作者 编者 本刊对来稿中统计学处理的有关要求 统计学处理部分应写明所用统计分析方法的具体名称( 如成组设计资料的 t 检验、 两因素析因设计资料的方差分析) ; 当涉及总 体参数时, 在给出显著性检验结果的同时, 再给出 95% 可信区间。对于服从偏态分布的定量资料, 应采用 M( Q) 方式表达, 不应采用 x & s 方式表达。对于定量资料和定性资料, 应根据所采用的设计类型、 资料所具备的条件和分析目的, 选用合适的统计分析方法, 前者 2 不应盲目套用 t 检验和方差分析, 后者不应盲目套用 # 检验。使用相对数时, 分母不宜小于 20; 要注意区分百分率与百分比。统计 学符号按 GB 3358 82∋ 统计学符号及名词(的有关规定书写, 一律用斜体。