【新技术分享】基因工程小鼠的制备及应用.pdf

基因工程小鼠的制备及应用 苏会敏 广东药康生物科技有限公司 江苏集萃药康生物科技有限公司 动物模型与疾病研究 致病基因 药物靶标 动物 模型 发病机制 药效模型 小鼠模型 Ø 与人类亲缘关系近； Ø 哺乳类模式动物发展程度最高； Ø 遗传操作手段先进； Ø 完成全基因组测序，遗传背景清晰； Ø 体型小，繁殖速度快，生命周期相对较短 发展历史及资质认证 技术与资源优势 l 小鼠模型创制能力全国第一 l 拥有疾病模型品系全国第一 l 国内最大的小鼠模型供应商 l 国内最早且连续四次通过AAALAC认证 l 大陆唯一的国际小鼠表型分析联盟成员 Mstn 敲除 Q Zou, et al. (2015). JMCB, 7(6):580-3 l 中国首个Cas9 基因敲除小鼠模型 l 中国首个Cas9 条件性基因敲除小鼠模型 l 中国首个Cas9 基因敲除大鼠模型 l 世界首个Cas9 基因敲除猴模型 l 世界首个Cas9 基因敲除犬模型 Ppar-g and Rag1双敲 Niu, Y., B. Shen, et al. (2014). Cell 156(4): 836-843. 模型定制平台 • 15年服务历史 • 亚洲最大规模的创制中心 • 10 套显微注射设备 • From Gene ID to hets mouse • 超过150人的专业技术人员 • 工业级通量： KO模型6000个/年 CKO/KI模型2300个/年 转基因模型2500个/年 • 按期交付率98.5% 基因工程 • 传统概念：又称为遗传工程, 是利用DNA重组技术，将目的 基因与载体DNA在体外进行重组，然后把这种重组DNA分子 引入受体细胞，并使之增殖和表达的技术。 • 新概念：对基因组进行改造 基因工程小鼠模型构建方法 Ø转基因技术 Ø基于胚胎干细胞打靶 技术 Ø现代基因编辑技术 转基因技术 第一只转基因小鼠（1982） Richard Palmiter and Ralph Brinster 转基因技术 原理： Ø 通过原核注射的方法制备转基因小鼠模型。 Ø 目的基因多拷贝串连的方式插入，插入位点随机 Ø 转基因片段的表达会受到插入位点附近的序列影响 转基因小鼠制作流程 0.5天受精卵 DNA载体 原核融合 体外发育 移植到假孕鼠输卵管 首建鼠 founder 可遗传 F1代转基因小鼠 转基因小鼠繁育路线 n 繁育目标：表达符合预期 n 对照选择：同窝阴性/背景鼠 n 繁育建议： 每只Founder分开繁育 多个line相互验证 杂合阳性保种 不能将founder鼠互相交配！ Founder1 Founder2 Founder3 Founder4 基因工程小鼠模型构建方法 Ø转基因技术 Ø基于胚胎干细胞打靶 技术 Ø现代基因编辑技术 Cappechi Evans Smithies 2007年诺贝尔生理医学奖 基因敲除小鼠（1987-89） 基因组编辑技术是建立动物疾病模型的核心 基于胚胎干细胞打靶技术 原理： Ø构建打靶载体，转染 到胚胎干细胞中， Ø筛选和鉴定，得到正 确中靶的胚胎干细胞 克隆 自删除技术，节省至少3个月繁育周期 基于胚胎干细胞打靶小鼠制作流程 原理： Ø 注射到供体囊胚中，发育 成嵌合鼠。 Ø 嵌合鼠与野生型的小鼠交 配，在后代中检测到成功 发生基因打靶、并且能够 遗传建系的小鼠。 特点：技术难度高、修饰准确、效果稳定、制作周期长、背景单一 基因工程小鼠模型构建方法 Ø转基因技术 Ø胚胎干细胞同源重组 技术 Ø现代基因编辑技术 现代基因编辑技术（无需ES细胞介导） 基因编辑：对基因组进行精确定点修饰从而达到对特定DNA片段的敲除、敲 入、替换、修饰等目的的技术 基因编辑技术要素：特异性DNA识别域 + 非特异性核酸内切酶 转录激活样效应因子核酸酶技术（TALEN） 锌指核酸酶技术（ZFN） Nature Biotechnology, 2011, 29(2), 143 Ø 缺点：组装复杂、难度大、成本高 Nature, 2005, 435(7042), 646 CRISPR/Cas9技术 成簇规律间隔短回文重复技术 (CRISPR/Cas9) Ø Cas9：两个核酸酶活性结构域，分别剪切 DNA双链 Ø Single-guide RNA：guide RNA靶向 + Scaffold RNA 结合 Cas9 Ø Protospacer Adjacent Motif（PAM序 列）：Cas9酶活性开启的必要条件 Ø 特点：成本低、效率高、覆盖度广、体系构建简单 CRISPR/Cas9 vs ES打靶 ES cell culture Vector construction Blastocyst Chimera 14~16 weeks Cas9 and sgRNA Preparation Heterozygous mouse 24 weeks One Cell Embryo Founder 2~6 weeks 周期明显缩短 无ES细胞限制，可选用小鼠背景多 GLT率高，可快速获得杂合子（6 months） Heterozygous mouse 24 weeks IVF Heterozygous Cohort CRISPR/Cas9技术-基因敲除 Cas9 Wildtype allele 1 1. Exon deletion 1 2. Frame-shift KO 1 3 2 3 3. Complete KO LEGEND UTR Coding Exon Genomic DNA Frameshift Coding Depends on sgRNA design strategy New UTR 基因敲入 CRISPR/Cas9 System CRISPR/Cas9 System Wildtype allele 1 3 2 1 2 3 * Donor Vector Gene ORF 2 1 pA * Flox Gene ORF pA LEGEND 1 2 UTR 3 Coding Exon 1 2 Genomic DNA 3 人源化小鼠模型 基因敲入（Cas9-H11 KI） G T R- E P SU 条件性表达或过表达：Stop 的选择 效率 高 更 段 片 更大 过表达模型的选择 转基因 • 周期短 • 成本低 • 技术难度低 • 可获不同表达量的模型 • 随机插入（位点、拷贝数） • 不能保证过表达 • 易破坏其他内源性基因 • 遗传稳定性差（多点插入） • 后期大量建系和筛选工作 ROSA26/H11位点敲入 •周期长 •成本高 •技术难度高 •获得的模型唯一 •按设计精确插入 •基本保证过表达 •不影响其他内源性基因 •遗传稳定性高 •无需筛选，直接用于分析 Cre 重组酶 Cre recombinase, a 38.5 kDa protein from bacteriophage P1, catalyzes reciprocal site-specific recombination between DNA elements termed lox sites. Cre 重组体系 Cre 删除 倒置 片段互换 条件性基因敲除 CRISPR/Cas9 System Wildtype allele 1 2 Donor Vector Flox 3 2 1 3 2 Cre Null 1 LEGEND 3 UTR Coding Exon Genomic DNA 条件性基因敲除 CreERT2：Inducible Knockout 优点 ü 提高基因编辑操作的时空精度（部位和时间调控） ü 与不同工具鼠灵活搭配使用，一鼠多用 ü 克服重要基因完全敲除后的胚胎致死或过早死亡 Cre 酶识别的Lox 条件性表达/倒置 LoxP/Lox2272(＞90%) ＞ LoxP/Lox511（65-73%） 条件性基因替换 点突变诱导表达 2 Donor and CRIS P R/Cas 9 S yst em ＊ 2 T GA AT G W ild- type allele 1 2 AT G 4 T GA 2 T ar get ed allele 3 ＊ 1 2 3 4 Cr e 2 OR ＊ 2 ＊ 2 2 Deletion Deletion T GA AT G After Cre/Lox p ＊ 2 1 Cas 9/s gRN A U ncoding r egion Coding r egion U ps tream of ex on2 3 ＊ M utant sit e Downs tr eam of ex on2 4 Lox p Lox 2272 遗传谱系示踪技术 Promoter STOP tdTomato pA Cre Promoter tdTomato pA Loxp 遗传谱系示踪技术 Cre-Loxp CAG Promoter STOP ZsGreen STOP tdTomato pA Dre-Rox Rox Cre Nat Med. 2017 Dec;23(12):1488-1498. 遗传谱系示踪技术 Nat Med. 2017 Dec;23(12):1488-1498. 现有全球小鼠资源状况 模型供应存在问题 10158 2585 4887 8640 16739 5826 From IMSR（October，2018） 最大的全球小鼠资源中心 斑点鼠计划 Dalmatian Mouse Action 22,951 个蛋白编码基因 完成 >20,000 条件性基因敲除品系，成为全球最大资源库 斑点鼠1001 斑点鼠2001 斑点鼠5001 1200个热点基因、半年完成 5000个基因、已启动设计 ……. 最大的全球小鼠资源中心 最大的全球小鼠资源中心 Cre工具小鼠 免疫系统 40种 神经系统 47种 骨、肌肉、 脂肪 21种 心血管系统 14种 其他 59种 消化系统 19种 从精准模型到精准医疗 • 动物模型创制及表型分析（⾃自主品系） TG/KO &Phenotypic analysis • 与精准医疗和新药研发、评估等紧密结合 New animal models for human diseases 谢谢! 因为专注、所以专业