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药学学报 A c ta Pharm aceutica S in ica 2007, 42( 9): 978- 981 978 HPLC UV ELSD 法同时测定青蒿中青蒿素、青蒿乙素和青蒿酸的含量 张 1 东, 杨 1* 1 2 岚 , 杨立新 , 王满元 , 屠呦呦 1 ( 1. 中国中医科学院 中药研究所, 北京 100700; 2. 首都医科 大学 中医药学院, 北京 100069) 摘要: 用 H PLC UV ELSD 法同时测定青蒿药材中 青蒿素、 青蒿乙素和青蒿酸的含量。采用 Nuc leodur C 18 色谱柱 ( 250 mm 4 6 mm, 5 m ID ); 以乙腈 0 1% 乙酸水 ( 50 50)为流 动相; 紫外 检测波长 209 nm, 蒸发光 散射检测器漂 移管温度 50 。结果显示, 青蒿素、 青蒿 乙素和青蒿酸能够达到很好分离。它 们的线性范 围分别为 0 52~ 2 6 r = 0 999 4( n = 5); 0 022~ 4 4 g, r = 0 999 9( n= 5); 0 203 ~ 8 12 g, g, r = 0 999 8( n = 5)。平 均回 收率分 别为 99 45% ( RSD = 2 3% , n= 6) ; 102 37% ( RSD = 1 7% , n= 6); 101 10% ( RSD = 0 79% , n = 6)。本法简单、准确、 快 速, 可同时测定青蒿药材中青蒿素、青蒿乙素和青蒿酸的含量。 关键词: 青蒿; HPLC UV ELSD; 青蒿素; 青蒿乙 素; 青蒿酸 中图分类号 : R 917 文献标识码: A 文章编号: 0513- 4870( 2007) 09- 0978- 04 D eterm ination of artem isinin, arteannuin B and artem isinic acid in H erba A rtem isiae Annuae by HPLC UV ELSD 1 1* 1 2 1 ZHANG Dong, YANG Lan , YANG L i x in , W ANG M an yuan , TU Y ou you ( 1. Institute of ChineseM ateriaM ed ica, China A cademy of Ch inese M ed ical S ciences, B eijing 100700, China; 2. College of T rad itional ChineseM edicine and Pharmacy, Cap italM edical Univers ity, B eijing 100069, Ch ina) Abstract: T o establish an H PLC UV ELSD m ethod fo r the determ inat io n of the content o f artem isinin, arteannu in B and artem isin ic acid in H erba Artem isiae Annuae. T he analyt ical co lum n w as Nucleodur RP C18 ( 250 mm 4 6 mm, 5 m ID ). T he m obile phase w as aceton irile 0 1% ace tic ac id - 1 ( 50 50) and the flow rate w as 1 0 mL m in w ith a UV detector for artem isin in, the detection w ave leng th a t 209 nm, and the evaporative light scatterin g detector ( ELSD ) for arteannu in B and artem isinic ac id, the drift tube temperature: 50 , the n itrogen f low rate 30 psi and the ga in w as 50. T he resolution o f artem isin in, arteannuin B and artem isin ic acid was good. The lin ear calibratio n curves w ere obtain ed over the range of 0 52 - 2 6 g for artem isinin ( r = 0 999 4, n = 5) , 0 022 - 4 4 g for artem isinin B ( r = 0 999 9, n = 5 ) and 0 203 - 8 12 g for artem isin ic ac id ( r = 0 999 8, n = 5) , separately. T he m ean recoveries of the three com pounds w ere 99 45% , 102 37% and 101 10% w ith RSD o f 2 3% , 1 7% and 0 79% , respect iv ely. T h ism ethod is sim p le, rapid, accurate and su itab le for th e determ inat ion of the conten t o f the th ree com pounds in the herbs. K ey words: H erba A rtem isiae Annuae; H PLC UV EL SD; artem isin in; arteannuin B; artem isinic acid 青蒿 ( H erba A rtem isiae A nnuae)为常用中药, 为 分。药理研究表明, 青蒿具有抗疟、调节免疫功能、 菊科植物黄花蒿 ( A rtem isia annua L. ) 的干燥地上部 抗血吸虫病和祛痰、镇咳、平喘, 抑制病毒、细菌 等作用。 20世纪 70 年代初, 我所研究人员从青蒿 收稿日期: 2007 01 22. 基金项目: 国家自然科学基金项目 ( 30572319) 资助. * 通讯作者 T e:l 86 - 10- 6401411- 2973, Fax: , E m a i:l ylan _66@ yahoo. com. cn 中发现了抗疟活性成分 青蒿素, 以青蒿素为先 导化合物, 国内外研发了双氢青蒿素、青蒿琥酯、 蒿甲醚、蒿乙醚等一系列抗疟药, 为当前抗药性疟 张 东等 : H PLC UV ELSD 法同时测定青蒿中青蒿素、青蒿乙素和青蒿酸的含量 疾治疗的首选药物。尽管有关青蒿素的化学合成和 色谱 分 析 条 件 979 色 谱 柱: Nuc leodur C18 ( 250 生物合成方法均有 报道, 但还 不能实现 工业化生 mm 产, 目前从青蒿中提取是获取青蒿素的唯一途径, 我国拥有青蒿资源优势, 是青蒿素的主产国。青蒿 ( 50 50) ; 流速: 1 0 mL m in ; 柱温: 25 ; 青 蒿乙素和青蒿 酸用 紫外 检测 器检测, 波长 为 209 素、青蒿乙素和青蒿酸为青蒿中倍半萜类成分, 均 nm; 青蒿素用蒸发光散射检测器检测, 漂移管温度 被认为是青蒿素生物合成的前体, 具有抗细菌、 抗 [ 1, 2] 真菌等活性 , 与 青蒿的传统功效一 致。文献报 50 , 载气 ( N2 ) 压力 30 psi( 1 psi 6 9 kP a) , 增 益值为 50; 进样体积为 10或 30 L。 道同时测定青蒿中青蒿素、 青蒿乙素、 青蒿酸的方法 有 H PLC UV ECD 法 [ 3] 、H PLC MS /M S法 [ 4] 4 6 mm, 5 m ID ); 流 动相: 乙腈 0 1% 乙酸 - 1 供试品溶液 的制备 取 粉碎 至细 粉 ( 过三 号 , 作者采 筛 ) 青蒿药材 0 5 g, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精 用 ELSD法检测仅有很弱紫外吸收的青蒿素、UV 法 检测青蒿中含量较低的青蒿乙素和青蒿酸, 建立了 密加入石油醚 ( 60~ 90 ) 25 mL, 密塞, 称定重量, 超声 ( 100 W, 40 kH z) 提取 50 m in, 放冷, 再称定重 同时测定青蒿中这 3种成分含量的 H PLC UV ELSD 量, 用石油醚补足减失的重量, 摇匀, 滤过, 取续滤液 法, 并对不同产地青蒿药材进行测定。 10 m L, 蒸干, 残渣加甲醇使溶解, 转移至 5 mL 量瓶 中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀、 过滤, 备用。 材料与方法 仪器与 材料 A lliance 高 效 液 相 色 谱 仪 及 Em pow er 2色谱工作站 ( W aters公司 ); W aters 2996 结果与讨论 1 方法的专属性 紫外检 测 器, 2420 蒸 发 光 散射 检 测 器 ( W aters公 对照品与青蒿药 材的 H PLC UV ELSD 色 谱图 司 ) ; NA 5L 氮气发生器 ( 北京中兴汇利科技发展有 限公司 ) ; KQ 100 型超声波清洗 器 ( 功率 100W, 频 见图 1, 由图 1可知, 青蒿素、青蒿乙素和青蒿酸的 分离良好。 率 40kH z, 昆山超声仪器有限公司 ) ; M illi Q 超纯水 2 线性关系考察 机 ( 美国 M illipore公司 ) ; 青蒿素、 青蒿乙素、青蒿酸 对照品 ( 本实验室自制, 经 H PLC 面积归一化法检 取干燥至恒重的青蒿素对照品适量, 精密称定, - 1 加甲醇制成 0 26 m g mL 溶液, 为青蒿素对照品 测, 纯度均大于 99% ) ; 青蒿药材经中国中医科学院 溶液。取干燥至恒重的青蒿乙素和青蒿酸对照品适 青蒿素研究中心屠呦呦研究员鉴定。 量, 精密称定, 加甲醇制成 0 11 mg m L 青蒿乙素 - 1 Figure 1 H PLC chrom atogram s of re ference ( A, B ) and the extract from H erba A rtem isiae Annuae ( C, D) . A, C: UV; B, D: EL SD; 1: A rteannuin B; 2: A rtem isin in; 3: A rtem isinic ac id 药学学报 A c ta Pharm aceutica S in ica 2007, 42( 9): 978- 981 980 - 1 和 0 203 m g mL 青蒿酸溶液, 为青蒿乙素和青蒿 收率, 结 果 回 收 率分 别 为 99 45% , 102 37% 和 酸的混合对照品溶液。 101 10% ; RSD 分别为 2 3% , 1 7% 和 0 79% 。 分别精密吸取青蒿素对照品溶液 2, 4, 6, 8和 10 L, 注入液相色谱仪, 用 ELSD检测器测定峰面 7 青蒿药材的测定 取所收集的 10个不同产地的青蒿药材, 按 供 积, 以进样量的对数为横坐标 ( X ) , 峰面积的对数 试品溶液制备 项下操作, 并精密吸取 10 L 或 30 为纵坐标 ( Y ) , 绘制标 准曲线, 计算回归 方程为: Y = 2 394 1X + 6 375 8, r= 0 999 4, 最低检测限为 L, 注入液相色谱仪, 测得青蒿素、青蒿乙素、青 蒿酸的含量。测定结果见表 1。 0 26 g。表明青蒿素在 0 52~ 2 6 g 内, 进样量 对数与峰面积对数呈良好线性关系。 分别精密吸取青蒿乙素和青蒿酸的混和对照品 溶液 1, 2, 10, 20和 40 L 及稀释 10倍的对照品 Tab le 1 Con tents o f artem isin in, artem isin in B, artem isinin ac id in H erba A rtem isiae Annuae from d ifferen t sources ( % ) 溶液 2 L, 注入液相色谱仪, 用 UV 检测器测定峰 Source 面积, 以进 样量为 横坐 标 ( X ) , 峰面 积为纵 坐标 ( Y ) , 绘制标准曲线, 计算青蒿乙素的回归方程为: Hun an j ish ou 0 69 0 004 5 - Hun an hux i ( w ild ) 0 823 0 004 9 0 034 Y = 2 135 000X - 6 251, r = 0 999 9, 最低检测限为 Hun an huxi ( cu lt ivated) 0 589 0 011 0 04 Hun an zhang jia jie 0 549 0 002 3 - Hun an hua ihu a 0 522 0 015 0 028 C hongq ing youyang 0 681 0 002 3 0 023 Shanxi guangling 0 164 0 115 0 541 Shanxi y ixing 0 081 0 069 0 341 Shanxi d iand ingshan 0 146 0 049 0 123 Indones ia 0 187 0 003 6 - 0 011 g。表明青蒿乙素在 0 022~ 4 4 g 内, 进 样量与峰面积呈良好线性关系; 青蒿酸的回归方程 为: Y = 2 341 000X - 98 750, r = 0 999 8, 最低检测 限为 0 040 6 g。表 明青蒿酸在 0 203~ 8 12 g 内, 进样量与峰面积呈良好线性关系。 3 精密度实验 取同一供试品溶液, 连 续进样 6 次, 每 次 30 A rtem is in in A rtem isinin B A rtem isin in acid - : N ot detected L, 测得青蒿素、青 蒿乙素和 青蒿酸峰 面积积分 值, 以青蒿素峰面积计算 RSD为 0 91% , 以青蒿乙 素峰面积计算 RSD 为 1 28% , 以青蒿酸峰面积计 讨论 算 RSD为 0 63% , 表明精密度良好。 法进行定量分析, 故选择用 ELSD法检测。用 ELSD 法也可检测青蒿乙素和青蒿酸, 但由于其灵敏度低, 4 稳定性实验 取同一供试品溶液, 分别于 0, 2, 4, 8, 12和 24 h进样, 测得青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸峰面积 积分值, 以青蒿素峰面积计算 RSD为 1 20% , 以青 青蒿素只有很弱 的末端紫外吸 收, 不能 用 UV 对这两个成分含量低的青蒿药材来说, 该法同时测 定 3种成分较困难, 故采用灵敏度较高的 UV 法对 青蒿乙素和青蒿酸进行定量测定。UV 检测器对所 蒿乙素峰面积计算 RSD 为 1 79% , 以青蒿酸峰面 积计算 RSD为 1 34% , 表明供试品溶液在 24 h内 测成分性质 无任 何影 响, 据此 本 文建 立了 H PLC 稳定。 本实验选择了正己烷, 石油醚 ( 60~ 90 )和氯 仿为提取溶剂进行考察, 结果正己烷对青蒿乙素提 5 重复性实验 精密称 取 同 批 青 蒿 药 材 粉 末 5 份, 每份 为 0 5 g, 按 供试品溶液制备 项下操作, 并取 10 L 进样。测定并 计算青 蒿素、青 蒿乙 素、青蒿 酸含 量, 5 次测定值 的 RSD 分别为 1 74% , 0 98% 和 0 75% , 重现性良好。 6 回收率实验 UV ELSD同时测定青蒿中 3种成分的方法。 取不完全, 石油醚 ( 60~ 90 ) 和氯仿均能对 3种成 分提取完全, 两者结果没有差异, 但是氯仿提取的样 品杂质多, 出峰较为复杂, 而石油醚 ( 60~ 90 ) 提 取的样品杂峰少, 对所测成分没有干扰, 所以选择石 [ 3] 油醚 ( 60~ 90 ) 作为提取溶剂。文献 报道测定 青蒿乙素和青蒿酸的紫外波长为 220 nm, 经过全波 采用加 样回收 法, 取 已知含 量的同 批样品 6 长扫描, 选择在 209 nm 下进行测定, 这两个化合物 份, 每份 0 25 g, 精密称定, 分别精密加入适量青 蒿素、青蒿乙素、青蒿酸, 按制备供试品溶液方法 响应值较高, 且无其他成分的干扰。 对不同产地的青蒿药材测定结果显示, 青蒿素 制备, 测定并计算青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸的回 含量高的药材, 青蒿乙素、青蒿酸含量很低; 青蒿素 张 东等 : H PLC UV ELSD 法同时测定青蒿中青蒿素、青蒿乙素和青蒿酸的含量 含量低的药材, 青蒿乙素、青蒿酸含量较高。由于青 蒿乙素、 青蒿酸是青蒿素生物合成的前体化合物, 该 测定结果对于研究青蒿植物体内青蒿素的生物合成 及如何提高青蒿素的含量有一定的参考价值。 981 志 ), 1993, 18: 44- 48. 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China J Chin M a t M ed ( 中 国 中 药 杂 《国际药学研究杂志》2008年征订启事 《国际药学研究杂志》原刊 名《国外医学药学分册》, 由军事医学科学院主管、军事 医学科学院 毒物药物 研究所主办, 是 以评述性论文为主的综合性药学期刊。设置栏目有综述、 专 家论坛、 研究论著、编译、 文摘 和医药信息 等。本刊根据 国内药 学科研、 教学、临床和生产的需要, 追踪报道世界各国药学领 域的新进展、 新动向、新技术和新 成果, 包 括药物化 学、 药剂 学、 药物代 谢、 药物分析、药理和毒理学、 生化药学和临床药学等 基础研 究和应 用研究 方面的内 容。刊登 内容既 有新颖的 基础 理论, 又有应用研究和临床实践, 适合于从事药学研究的科技人 员、临床医 师和药师、制 药工程技 术人员, 以 及医药院 校师 生阅读和参考。被国内外多种数据库和检索期刊收录。是中国生物医学核心期刊。 本刊为双月 刊, 大 16 开 本, 80 页, 国 内 外 公开 发 行, 每 期定 价 10 00 元。 国内 邮 发代 号: 82- 135; 国 外 代 号: BM 6568, 国外发行: 中国 国际图书贸易总公司 (北京 399信箱 )。欢迎广大读者在当 地邮局订阅, 也可 直接与编辑 部联系 补订。 地址: 北京市太平路 27号六 所《国际药学研究杂志》编辑部 (邮编: 100850) 电话: 010- 66931618, 010- 66931637 E m a i:l guo @ l nic. bm .i ac. cn