LeicaSP8激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册.pdf

Leica 激光扫描共聚焦显微镜 快速操作手册 制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司 2013 年 3 月 1 目录： 1 系统的组成 系统组成……………………………………….………..………3 光路示意图………………………………………….…….……4 2 系统的使用 2.1 开机顺序…………………..…………….…….…………5 2.2 软件界面简介…………..…………….………..………7 2.3 在显微镜下观察样品.…………….……….….……8 2.4 采集共聚焦图像………..…………….………….…..9 2.5 XYZ三维扫描（Z-Stack）………………………..…11 2.6 时间序列扫描（Timeseries or xyt Scan）…15 2.7 波长扫描（xyλ Scan）…………………………..16 2.8 HyD检测器……..………………..………………...…….17 2.9 图像的保存及输出………..…………….…….…….18 2.10 关机………..…………….…………………………..……20 3 系统的维护..…………….…………………………….……21 2 Leica SP8 系统组成图 3 1 可见波长激光或白激光 15 UVIS, HIVIS或VISIR的光路镀膜 2 声光调制器（AOTF） 16 扫描视场旋转镜（Abbe-Konig 旋转）* 3 红外激光（IR）* 17 在NND位置上的反射光检测器（RLD）* 4 电光调制器 18 物镜（可提供各种选择）* 5 紫外激光* 19 在NND位置上的透射光检测器（TLD）* 6 AOTF或直接调制器（DMOD） 20 正方型针孔 7 STED 激光* 21 Fluorifier盘* 8 Setlight监控二极管 22 X1出口接口* 9 AOBS, 及其他选配件 23 外置检测器* 10 用于FRAP的光束增强镜* 24 色散棱镜 11 红外激光耦合 25 分开的荧光光谱 12 与CS2紫外光路耦合的紫外激光 26 最多5个光电倍增管或4个HyD检测器 13 STED激光耦合 *选配组件 14 全视野扫描镜及串行高速扫描镜选件 4 2 系统的使用 2.1 开机顺序 （硬件标号请参考前面的系统组成图） （1）因为 FSU 和 CSU 硬件的电源控制 ）不同，请分别按照如下步骤开机： FSU 系统 CSU 系统 依次打开“PC Microscope” 、 “Scanner Power” 、 先按电脑主机上的电源按钮启动电脑，再打 “Laser Power”三个按钮，将“Laser Emission” 开显微镜控制器 的开关，然后依次打开 上的激光开关钥匙旋至“On-1 “Scanner Power” 、 “Laser Power”两个按钮， 将“Laser Emission”上的激光开关钥匙旋至 “On-1 注意：显微镜控制器的开关 一般是常开 的，在打开“PC Microscope”按钮后指示灯 应该点亮，如果不亮，请打开其开关。 之后两个系统的操作一样 （2）打开荧光激发光源 （按绿色的 Power 按钮，如右图） 光源亮度调节旋钮 Power 按钮 光闸 5 （3）电脑进入操作系统界面后，双击电脑桌面“LAS AF”图标启 动共聚焦操作软件。 （4）进入配置选择界面后，在 “Configuration”下拉菜单中选择需要的 配置； （其中带有“simulator”字样的为模 拟方式，该方式不控制显微镜硬件，不能 拍摄图像，适合处理数据）“Microscope” 菜单中选择显微镜型号； （图中“Resonant” 选项为快扫功能，可按需要打开或关闭， 只有配备了快扫功能的系统才会显示该 选项） ，点击“OK” ，系统继续启动。 （5）在“Initialize Stage”提示界面选择是 否初始化载物台（如果选择“No” ，则 Tile scan、 Mark&Find 和 Matrix 功能不能使用） 。 注意：如果配置的是手动载物台，则不 会跳出该提示界面。 （6）系统自检完后，进入 LAS AF 操作界面， 点击界面最上方“Configuration”按钮进入配置界面→点击左边“Laser Config” 按钮→打开所需激光（OFF→ON） ，Argon 激光还需拖动右方滑块以调节激光输出 功率 6 2.2 软件界面简介 功能界面切换：参数设定（Configration） 、扫描取图（Acquire）、图像处理（Process）、 定量测量（Quantify） 工具和 文件管理 界面切 换： Experiments 界面 下显示当 前拍摄和打开 的图片 ， Acquisition 下显示的是当前功能界面的功能按钮和参数 拍摄参数：包括图像像素 Format、扫描速度 speed、图像放大 Zoom factor、视野旋转 Rotation 等。 三维扫描工具组，用于设定和显示三维扫描的 Z 轴范围，及其他辅助设定 光路显示及设置区域，从上向下直观显示了从激发到荧光检测的光路细节和关键设置 图像显示窗口 预设光路选择按钮 激光控制栏 分光镜选择按钮 物镜选择按钮 预览按钮，可用于开始和停止预览 拍摄图像按钮 叠加图像显示按钮，在使用两个或以上数量通道拍摄多色图像时，用于显示所有通 道叠加后的图像 界面缩放调节滑块，左右拖动可以调节界面项目的显示比例 界面调整栏，左右拖动可调整光路设置区域与图形显示窗口的范围 7 2.3 在显微镜下观察样品 2.3.1 选择物镜：可通过显微镜主机右侧的物镜转换按钮，或软件中的“Objectives” 按钮进行选择（如下图）。（在显微镜设置软件 Leica AF Hardware Configurator 中可设定最下方的红圈中的按钮为干/油镜转换，在干/油镜之间切换时需要先按 一下此按钮才能完成转换） 2.3.2 明场观察：将样品置于载物台上，按显微 镜左侧的 TL/IL 按钮打开明场光路 （如右图） （因 显微镜所处状态不同，有时候需要按两次才能 打开），在明场条件下选择合适的视野。通过 调焦按钮或旋钮调节至合适的 z 轴平面，通过 显微镜主机左侧的“INT”功能键调节光强。 如果是电动载物台，需通过遥控手轮调节 载物台的运动以选择合适的视野（如下图） 。 2.3.3 按显微镜前面板的荧光滤块选择按 钮切换至荧光观察光路（如右图所示） ，其 上的标注与荧光颜色的对应关系为：I3 绿色，N2.1--红色，A—蓝色，有些配置的 显微镜按钮对应的荧光颜色可能会有所不 同，请以实际情况为准。 再按荧光光闸按钮（SHUTTER）打开 荧光，进行样品的荧光观察。 2.3.4 观察完毕后，按显微镜前面板上的 8 “SHUTTER”按钮以保护样品 2.4 采集共聚焦图像 2.4.1 光路设置： 调用已有的设置：选择“Load/Save single setting”下拉菜单中已有的设置，激光波长及 其输出功率、分光镜、检测波长范围、检测器 gain 及 offset 都会自动设置，包含几种最常用 的荧光染料。选择某一设置后，可按样品的实 际情况对参数进行优化（如后述），并以新的 名称保存。（如右图） 修改已有设置：可改变所选激光、调节激 光输出功率、改变分光镜、改变所选 PMT、调 节 PMT 检测范围、调节 PMT 的 gain 或 offset 等。如下图。 建立新的设置：也可从零开始建立新的设置。选择所需激光及其功率、 适宜的分光镜、检测器及检测波长范围。 9 分光镜选择原则：根据所用激光 波长来选择合适的分光镜。 1 405 激光选择 Substrate；○ 2 其 ○ 他可见波长的激光根据其波长选择分 光镜， 如 488 激光可选择 DD488/552、 3 RT 15/85 分 TD488/552/638 分光镜。○ 光镜所有波长激光都可用，但是会损 失 85%的激光能量和 15%的荧光能量，一般在当现有分光镜无法满足当前激 光谱线组合或进行光谱扫描的时候选用。 Sequential Scan:若染料的发 射光谱有重叠，为减少串色，成像 时每种染料要单独激发，或者说， 每次只用一种激发光激发，并只检 测一种染料。可用 Sequential Scan 来实现。 （如右图）激活 Sequential Scan 功能，可在下面的 Seq 中分别 设置各个染料的激发和检测光路。 2.4.2 选择扫描模式 默认模式为 xyz 扫描，是最常 用的扫描模式，可用于 xy 扫描和 z 轴层切（xyz 扫描）。还可在下拉 菜单中选择由 x，y，z，t （时间） 以及λ（波长）组合而成的多维扫 描模式， 如 xzy，xyt，xyλ，xyzt， xyzλ，xyzλt 等。 2.4.3 设置扫描参数 包括分辨率（format） 、扫描速 度（speed） 、针孔大小（pinhole） 、 线平均（line average） 、面平均 （frame average） 、累加 （accumulation）及放大倍数（Zoom） 等。（如右图） 分辨率：默认值为 512×512。也可选择更低或更高分辨率。分辨率越 高，所获取的图像文件越大，采图所需时间也越长。 扫描速度：默认值为 400Hz。活细胞或运动的样品成像可能需要更快的 速度。可选择双向扫描（Bidirectional X）来达到更高速度，这时可能需要 进行相位校准（Phase correction） 。 针孔大小：默认值为 1AU。如果增大针孔直径，可增加信号强度，但是 所获取图像的共聚焦效果会降低，光切厚度也会随之增加。 平均：用于降低背景噪音。分为线平均（Line average）和面平均（Frame average），可在下拉菜单中选择平均的次数。 10 累加：仅用于荧光非常弱的样品 2.4.4 预览图像 点击软件 Acquire 界面左下方的“Live”按钮以预览图像（下图） ，图像 将显示在右侧的显示屏上。 预览开始后， “Live”按钮变为“Stop”，点击“Stop”按钮可停止预览。 注意：一旦预览开始，激光开始照射样品，为减少对样品的伤害，应 快速操作，尽量减少预览的时间。 建议：点击 Live 按钮之前，可调节 format 至 512×512，speed 至 600Hz 以获得较快的刷新频率。 1 找到最适合观察的焦平面；○ 2 使图像亮度动 预览应达到以下目的：○ 态范围达到最佳。 可通过调节控制面板的“Z Position”旋钮找到最适合观察的焦平面（如 下图） ；或者调节遥控手轮或显微镜镜体上的调焦旋钮（见第 8 页图） 。 图像亮度动态范围可通过调节激光输出功率（见第 9 页图）、Smart Gain 和 Smart Offset（见上图） 。 参数的调整原则： （1）Smart Gain 的调节：增大则信号和噪音都增强，减小则信号和噪音均减小。 一般情况下，Gain 值的正常范围为 500—1000； （2）Smart Offset 的调节：可扣除背景噪音，但标本信号也有一定程度的扣除。 原则上，在保证图像质量的前提下，Digital Offset 值越接近于 0 越好； （3）另外，对于每个通道，需要灵活调节激光的强度：激光强度越高，则信号 越强，同时标本更容易被漂白或淬灭。当 PMT gain 值高于 800 或 HyD gain 值大 于 100%时荧光图片亮度还是不够时，可以考虑适当增加激光强度。在做活细胞 或者光切时，应尽量减少激光强度，原则上，在保证图像质量的前提下，激光强 度越低越好。 11 图像亮度动态范围的判断方法： 理想的荧光图像中应该只有少数像素点达到饱和，可通过位于图像左侧的 LUT按钮进行观察。。LUT 按钮（下图红圈）可在LUT （即指定的荧光颜色，也称 伪彩） 、 “Glow Over Under （GlowOU）”和灰度图三档之间切换。在GlowOU 模 式中，灰度值达到饱和的像素点显示为蓝色，而灰度值为0的像素点显示为绿色。 调节Smart Gain使图像中仅少数像素点呈蓝色，调节Smart Offset来降低图像的背 景。荧光图像Smart Offset的默认值为0%，通常应将其调为负值以使图像背景呈 绿色。下图中B图亮度及背景值设置均未达最优化值，调节Smart Gain和Smart Offset后，达到C图中的效果，部分信号呈蓝色，而背景呈绿色。 对于HyD检测器，其背景噪声很低，无需通过调节Smart Gain来降低背景。 对透射光图像，同样可以调节透射光PMT 的电压和偏移值来进行优化，有 时可将Smart Offset调至高于0%以增加对比度。 如果启用了Sequential Scan，在应该在每个扫描序列（Seq）分别通过预览来 调整图像亮度。 2.4.5 采集图像 对于单通道染色，或多通道染色同时扫描，单击“Capture Image”按钮采集 图像。对于序列扫描，或多维图像扫描，单击”Start”按钮进行图像采集。（见 下图）在此之前可改变扫描分辨率、线/面平均次数等扫描参数。 扫描分辨率的设置原则： 通常情况下，采集图像时，为充分利用物镜的分辨能力，可直接点击 “Optimize xy Format”按钮（如下图），由系统自动设置最佳分辨率。 12 根据Nyquist 采样原则，像素点大小（Pixel Size）应为物镜侧向分辨率（即 xy 平面分辨率）的2/5~1/2。物镜分辨率可点击物镜参数表按钮从弹出的界面读 取，像素点大小可在采图参数设置界面获得。像素点随扫描分辨率增大和放大倍 数（zoom）增加而减小。与高倍物镜相比，低倍物镜需要更高的扫描分辨率。 2.5 XYZ三维扫描（Z-Stack） xyz 扫描模式为默认采图模式，加上Z轴扫描多个层面， 适合观察样品中目标的空间分布。 现有的LAS AF软件3.0和3.1版本Z-Stack的设置界面不同 （如下图所示），但是基本采图流程类似。 2.5.1选择Z轴驱动方式 根据不同的系统配置，可以点击Z轴驱动方式按钮选择“z-Galvo”或者“z-Wide” 方式： “z-Wide”：使用显微镜固有的Z轴调节方式，倒置显微镜调节物镜的升降， 正置显微镜调节载物台的升降，可通过显微镜镜体的调焦旋钮和遥控手轮的调焦 旋钮控制。 “z-Galvo” ：使用选配的SuperZ进行精细的Z轴调节，只能通过控制面板的“Z Position”旋钮控制。 2.5.2 设置光路参数，方法同前。 2.5.3 设置Z轴范围 点击“Live”进行图像预览，调节z 轴至层切所需的起点，点击扫描起始设 置按钮定义层切起点，调节z 轴至层切所需的终点，点击扫描结束设置按钮定义 13 层切终点，点击“Stop”终止图像预览。 2.5.4 Z轴参数调整 此时xyz 层切菜单中显示的“z-step size” （相邻两个光切面的间距）和“Nr. of steps” （层切数目）为系统的优化值（“system optimized”）。也可点击“Nr. of steps” 左侧的按钮，然后对相邻光切面间距或层切数目进行自定义。 2.5.4 采图 选择合适的分辨率和扫描线速度，点击”Start”进行xyz 图像的采集。 采图完毕后，3.1版本的点击清除已设位置按钮，3.0版本的分别点击扫描起 始和结束位置设置按钮，使其变为灰色，使Z轴位置重新处于未定义状态，以免 影响下次采图。 2.5.5 3D展示 拍摄完3D图像之后，在图像显示窗口右侧会多出3个用于3D图像显示的按钮： 最大亮度投影按钮（Maximum projection）: 将所有Z平面的图像信息选取最 亮的点集中显示在一层，相当于将多层图像压成一层，多用于集中显示跨越多个 层面的结构信息。 正交剖面方式按钮（Orthogonal section）: 分别以XY、YZ、XZ三个方向显示 指定位置的剖面信息，如下图，多用于观察结构在3D空间内的定位。 3D立体模式按钮（Open in 3D viewer）: 打开3D可视化模块，以直观方式展 14 示3D结构，如下图，该模块功能强大，有多种参数可以调整显示方式，亦可以 将所观察到的图像输出成视频。 2.6 时间序列扫描（Timeseries or xyt Scan） 时间序列扫描多用于活细胞成像，记录动态过 程。 2.6.1 在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中 选择xyt 扫描模式后，将出现xyt 扫描菜单，如右图。 2.6.2 设置光路参数，方法同前。 2.6.3 定义“Time Interval”，即采集相邻两帧图 像所需的时间间隔，也可选择最小值“Minimize” 。 2.6.4 按采图需要选择“Acquire until stopped” 、 “Duration”或“Frames” 。 若选择“Acquire until stopped” ，则图像将持续 采集，直至手动终止。 若选择“Duration”，可定义采图所需的总时间。 若选择“Frames”，可定义所需的图像帧数。 2.6.5 选择合适的分辨率和扫描线速度，点击 “Start”进行时间序列图像的采集。 15 2.7 波长扫描（xyλ Scan） 波长扫描常用于自发荧光或新染料发射 光谱的检测，如果有串色严重的标本需要进行“Spectrum Dye Seperation”，必须 进行波长扫描。 2.7.1 在“Acquire”菜单栏的“Acquisition”中选择xyλ 扫描模式后，将 出现波长扫描菜单，同时检测通道变为如下方式： 2.7.2 选择合适的激发光和分光镜。 2.7.3 定义“Detection Begin”（需检测的发射谱起点）和“Detection End” （需检测的发射谱终点） 。起点所在波长应大于激发波长。 2.7.4 定义“Detection Band Width”（接收的带宽），通常为10nm。如果图 像较暗，可以增加带宽，但是光谱数据的精度会降低。 2.7.5 定义“No. of Detection steps” （采集的帧数）或“λ-Detection Stepsize” （波长步进）。波长步进不应大于接收带宽。 2.7.6 选择所用PMT检测器（或HyD检测器）。 2.7.7 选择合适的分辨率和扫描速度，点击“Start”进行发射波长图像的 采集。 2.7.8 扫描结束后，可保存发射光谱信息。操作路径为： 16 “Quantify→Tools→Stack Profile”，如下图： 在图像窗口的右下角，拖动波长λ滑块，显示的图像会随之变化，选取有典 型结构的一张； 在图像窗口上方选项画图工具，圈一个典型区域，中间的Graphs窗口即显示 出该区域的发射光亮度随波长变化的曲线（上图中的绿色曲线）； 在上图所示位置点击鼠标右键，弹出的选项中有一个“Export to Dye Data Base”的选项，点击，弹出命名新染料的对话框； 输入染料名称、激发波长（最大发射波长系统会自动计算出，也可以自己修 改）、备注信息等，点击“OK”，新染料数据即被存入系统的染料数据库。 可以通过“Configuration/Dye Database”去查看，加入数据库的染料可用于 以后采图的参考。 2.8 HyD检测器 HyD检测器是高性能的检测器，比PMT更灵敏响应速度更快， 并且有更多的功能。HyD检测器有三种操作模式可供选择： Standard：标准模式，跟PMT一样，检测到的信号直接显示 为图像，可通过调节SmartGain来调节图像亮度。 Counting：光子计数模式，以每个像素点所检测到的光子数 显示为该像素点的亮度，此时检测器的Gain为一个定值，通过长 时间的检测使图像显现出来。常用于非常弱的荧光样本的成像。 使用此模式采图时，需使用累加（accumulation）功能来使采集 到的图像达到合适的亮度。 BrightR：如果视野中有非常亮的结构，但是又需要将较暗的结构显示出来时， 17 适合用此模式，此模式会在较为暗 的部分使用稍多一些的动态范围， 如右图。 注意：HyD检测器非常灵敏， 如果收集到过强的光信号会影响 其寿命，系统有一个安全机制对此 进行保护，如果信号过强，会先有 声音报警，如果操作者未采取措施， 会自动关闭检测器，同时弹出如下 的提示窗口： 此时应点击“Stop”停止预览，降低激光功率，调低SmartGain值，重新预 览。 特别注意： 1 使用HyD成像时，一开始激光功率不要设置太高，应从低开始慢慢增加； ○ 2 不要用HyD检测反射光，因为一般情况下，反射光亮度要大大强于荧光。 ○ 2.9 图像文件的保存及输出 2.9.1图像文件的操作： “Acquire”的”Experiment”下显示采集的所有图像文件名称，默认本次开 机后采集的所有图像都放在一个文件夹下，右键点击文件名，可进行多种操作。 如下图： 18 选择“Save Experiment”即可将当前文件夹下的所有图片保存为一个文件， 文件保存格式为*.lif 原始文件，只能通过Leica LAS AF、LAS AF Lite 或其他专业图 像数据处理软件打开。 2.9.2图像文件的输出： 右键点击图像文件名，选 择”Export”进行图像输出，可输出成 图片（.tiff 或.jpeg） ，三维或多维图 像还可输出成电影（QuickTime、.avi、 MPEG-4、WMV等） 。如右图。所得 文件可用普通图像浏览软件打开。 选择”As Tiff”或”As JPEG”，出现如下图的对话框，可选择输出路径、所 需标尺及位置等。确定后，点击”OK”，即可将图像输出至指定路径。 19 2.9.3图像采集参数的观察及恢复： 右键点击图像文件名，选择”Properties of…” ，即显示该图像采集时的所有 参数设置信息，如图8-5。 点击”Apply Settings” ，即可恢复该图像采集时的参数设置。点击”Save as...” ， 可将所有参数信息输出成.xml文件并存至指定路径。 2.10 关机 （1） 保存已采集的图像。 （2） 在LAS AF软件Configuration”→“Laser Config”界面关闭所有激光。 （3） 关闭显微镜荧光电源。 （4） 若使用过油镜，需用无水乙醚与无水乙醇混合液（体积比7：3）或无 水乙醇清洁镜头。 （5）关闭LAS AF 软件。 （6） 将电脑桌右侧“Laser Power”按钮右侧的激光开关钥匙（Laser Emission） 逆时针旋转90度至“On-0”位置。 （7） 关闭“Scanner Power”按钮。 （8） 在电脑上进行图像数据的输出。 （9） 关闭电脑后，关闭“PC Microscope”按钮（CSU系统需关闭显微镜控 制器开关） 。 20 （10） 风扇停止后（关闭激光开关钥匙约5分钟后） ，关闭“Laser Power” 按钮。 （CSU系统可直接关闭“Laser Power”按钮，无需等待风扇停止）。记录关 机时间、仪器状况等信息。 3 系统的维护 （1）保持室温为18-25℃，相对湿度40-60%，尽量保证室内环境的清洁。 （2）严格遵守激光器的开、关流程。 （3）如荧光光源为汞灯，则打开电源后需等10-15min方可使用；如荧光光 源为金属卤素灯，则打开电源后可直接使用。无论哪种灯作为光源，打开后20min 以上才能关闭。 （4）如需用到“Mark and Find”、 “Tile Scan”、 “Matrix”等要求载物台精确 定位的功能时，在启动软件后选择进行载物台初始化，否则也可不做初始化。在 初始化过程中，载物台会向四周运动，因此需保证周围没有物品阻碍其运动。 （5）若使用过油镜，需用蘸有无水乙醇的擦镜纸清洁此物镜；若使用过水 镜，也需用干擦镜纸轻轻吸干上面的水渍。 （6）关机前，尽量将当前物镜转换为低倍物镜并调至最低位，可最大程度 保护物镜。 （7）输出数据时，使用光盘刻录数据而非移动存储设备可更好的防止电脑 中毒。 （8）避免空调直接对着显微镜吹风。 （9）拍摄图像时，应避免震动、环境光线、手机信号等的干扰。 如欲了解LEICA SP8的更多详细应用，可按在软件界面按“F1”键， 点击界面上出现的“？”圆形按钮打开帮助系统。 也可浏览以下网站： http://www.leica-microsystems.com/science-lab/ 21