04茯苓原生质体制备与再生条件的优化.pdf

第３ ４卷第 ４期 ２ ０１ ５年 １ ２月 武 汉 轻 工 Ｊ ｏｕｒ ｎａｌ ｏ ｆ Ｗ ｕｈａ ｎ 大 学 学 Ｐｏｌ ｙｔ ｅ ｃｈｎｉ ｃ 报 Ｖｏ１ ．３４Ｎｏ．４ Ｕｎｉ ｖｅｒ ｓｉ ｔ ｙ Ｄｅｃ．２０ｌ５ 文章 编号 ： ２０９５－ ７３８６（ ２０１ ５） ０４－ ００１１４） ０ ＤＯＩ ： １ ０． ３ ９ ６ ９／ ｊ ．ｉ ｓ ｓ ｎ． ２０ ９ ５－ ７３ ８ ６． ２ ０１ ５． ４． ０ ０ ０ ４ 茯苓原生质体制备 与再生条件 的优化 汪 琪， 赵小 龙 ， 陈 平 （武汉轻工大学 生物与制药 工程 学院 ， 湖北 武汉 ４３ ０ ０ ２３） 摘 要 ：对 茯苓 原 生质体 形 成与 再 生条件 进行研 究。分 别从 茵丝 茵龄 、酶 种 类及 浓度 、酶解 时 阃、酶解 温度 ４个方 面优化 了原 生质体 的制 备条 件 ， 从 再 生培 养基 的成 分 、 原 生质 体涂 布方 法 、 酶解时间 ３个方面优化原生质体的再生条件 。结果表 明： 采用培养 ６天的茯苓 茵丝， 在 ３． ５％ 溶壁 酶 ＋１％ 崩 溃 酶 的 混 合 酶 液 中， ３６ 酶 解 ２．５－３ｈ，获得 的原 生质 体 产 量 最 高 ，可 达 到 ３９．３８×１０ 个／ｇ，双层 涂布 再 生率 可达 ３２． ７％ 。 关键 词 ： 茯苓 ； 原 生质 体 ； 制备 ； 再生 中图分类 号 ：Ｑ ７１ 文献标 识 码 ：Ａ Ｔｈｅ ｏｐｔ ｉ ｍｉ ｚｅｄ ｃｏｎｄｉ ｔ ｉ ｏｎｓ ０ Ｐｏｒ ｉ ａ ＣＯＣＯＳ ｐｒ ｏｔ ｏｐｌ ａｓｔ ｓ ｐｒ ｅｐａｒ ａｔ ｉ ｏｎ ａｎｄ ｒ ｅｇｅｎｅｒ ａｔ ｉ ｏｎ ＷＡＮＧ ＱｉＺＨＡＯＸｉ ａｏ— ｌ ｏｎ ｇ。 ＣＨＥＮ Ｐ ｇ （Ｓｃ ｈｏ ｏ ｌｏｆＢｉ ｏ ｌ ｏｇ ｙａ ｎｄＰｈａｒ ｍａ ｃｅ ｕｔ ｉ ｃａ ｌＥｎｇｉ ｎｅｅ ｒ ｉ ｎｇ， ＷｕｈａｎＰｏｌ ｙ ｔ ｅｃ ｈｎｉ ｃＵｎｉ ｖｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ， Ｗｕｈａ ｎ４３００２３， Ｃｈｉ ｎａ） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ：Ｓｏｍｅ ｆ ａｃｔ ｏｒ ｓ ｔ ｈａｔａｆｅｃｔ ｅｄ ｔ ｈｅ ｆ ｏｒ ｍａｔ ｉ ｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒ ａｔ ｉ ｏｎ ｏｆｔ ｈｅ Ｐ０ ＣＯＣＯＳ ｐｒ ｏｔ ｏｐｌ ａｓｔ ｓｗｅｒｅ ｒｅｓｅａｒ ｃｈｅｄ． Ｃｅｌ ｌａｇｅ，ｅｎｚｙｍｅ ｓ ｙｓｔ ｅｍｓ， ｄｉ ｇｅｓ ｔ ｉ ｎｇ ｔ ｉｍｅ ａｎｄ ｔ ｅｍｐｅｒａｔ ｕｒｅ ｗｅｒ ｅｔ ｅｓｔ ｅｄ ｔ ｏ ｏｐｔ ｉ ｍｉ ｚｅ ｔ ｈｅ ｃｏｎｄｉ ｔ ｉ ｏｎ ｏｆｐｒ ｏｔ ｏｐｌ ａｓｔ ｓ ｐｒ ｅｐａ。 ｒ ａｔ ｉ ｏｎ．Ｒｅｇｅｎｅｒ ａｔ ｉ ｏｎ ｃｕｌ ｔ ｕｒｅ ｍｅｄｉ ｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ， ｃｏａｔ ｉ ｎｇ ｍｅｔ ｈｏｄ，ｄｉ ｇｅｓｔ ｉ ｎｇ ｔ ｉ ｍｅ ｗｅｒ ｅｓ ｔ ｕｄｉ ｅｄ ｔ ｏ ｏｐｔ ｉ ｍｉ ｚｅ ｔ ｈｅ ｃｏｎｄｉ — ｔ ｉ ｏｎ ｏｆｐｒｏｔ ｏｐｌ ａｓｔ ｓｒ ｅｇｅｎｅｒ ａｔ ｉ ｏｎ．Ｔｈｅ ｒ ｅｓ ｕｌ ｔｒｅｖｅａ ｌ ｅｄ ｔ ｈａｔｉ ｎｔ ｈｅ ｃｏｎｄｉ ｔ ｉ ｏｎ ｏｆｔ ｈｅ ｍｙｃｅｌ ｉ ｕｍ ｃｕｌ ｔ ｉ ｖａｔ ｅｄ ｆ ｏｒ６ ｄａｙｓ， ｆ ｏｒ ｅｎｚｙｍｏｌ ｙｓ ｉ ｓｉ ｎ ｍｉ ｘｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓｏｌ ｕｔｉ ｏｎｃｏｎｔ ａｉ ｎｉ ｎｇ３．５％ Ｌｙｗａｌ ｌ ｚｙｍ ａｎｄ ｌ％ Ｄｒ ｉ ｓｅｌ ａｓｅａｔ３６ ℃ ｆ ｏｒ２．５—－ ３ｈｏｕｍ 。 ｔ ｈｅ Ｐｏｆ ｉａ ＣＯＣＯＳ ｐｒｏｔ ｏｐｌａｓｔ ｓｙｉ ｅｌ ｄ ＷａＳ ｔ ｈｅ ｈｉ ｇｈｅｓｔ ．Ｔ ｈ ｅ ｐｒｅｐａｒａｔ ｉ ｏｎ ｒ ａｔ ｅ ｃａｎ ｒｅａｃｈ ３９．３８ Ｘ １０ ／ｇ，ａ ｎｄｔ ｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔ ｉ ｏｎ ｒ ａｔ ｅ ｃａｎ ｒｅａｃｈ ３２．７％ ｗｉ ｈ ｄｏｕｂｌ ｔ ｅ ｃｏａｔ ｉ ｎｇ． Ｋｅｙｗｏｒ ｄｓ： Ｐｏｒｉ ａ ＣＯＣＯＳ；ｐｒ ｏｔ ｏｐｌ ａｓｔ ｓ；ｐｒｅｐａ ｒａｔ ｉ ｏｎ；ｒ ｅｇｅｎｅｒ ａｔ ｉ ｏｎ １ 引言 药 用 茯苓 是指 多孔 菌科 茯 苓 属 真 菌茯 苓 （Ｐｏ ｒ ｉ ａ Ｃ Ｏ Ｃ ＯＳ（Ｓｃｈｗ．）Ｗｏｌ ｆ ）的干燥 菌 核 … ，它是 我 国常 用 的 我 国是 世 界 上 唯 一 进 行 茯 苓 栽 培 的 国 家 。近 年 来， 对于茯苓化学 、 药理方面 的研究 比较深入 ， 而有 关 其生 物 特 性 方 面 的 文 章 并 不 多 见 。虽 然 １ ９８０ 大众药材品种之一 ， 具有极高 的药用价值和膳食营 年以后 ， 有 关食 用菌原 生质 体分 离的报 道 大量增 加 － ５ ］ ， 但对茯苓原生 质体分离制备 的系统研究较 养价值 ， 人药能够利水渗湿 、 益脾 和 胃、 宁心安神 。 少。 为 了 以后 对茯 苓 在 微 生 物方 面进 行 更进 一 步 的 收稿 日期 ： ２０１ ５— １ ０－ ２６． 作者简介 ： 汪 琪 （１ ９９０一 ）， 女， 硕士研究生 ， Ｅ－ ｍａｉ ｌ ： ６９ ４７１１ ７６０＠ ｑｑ．ｃｏ ｎ ｒ 通信作者 ： 陈平 （１ ９５８一 ）， 女， 教授 ， Ｅ— ｍａ ｉｌ ： ｃ ｈｅｎｐｉ ｎｇ ｖ ｉ ｐ ２４＠１ ６３． ｃｏ ｎ． ｒ １ ２ 武 汉 轻 工 探索 ， 笔 者对 茯苓 原 生 质体 的制 备 进 行 了一 些 试 验 研究。 大 学 学 报 ２ ０１ ５矩 ３ 实验 方 法 ３．１ 原 生 质体 的制备 ２ 材 料 与试 剂 ２．１ 茯 苓菌 株 购 自广 东省微 生物 菌种 保藏 中心 。 ３．１．１ 茵丝体 培养 在 ＰＤＡ平板 上 ， ２５℃下培 养茯 苓 ＧＩ Ｍ５．２１ ９菌 株 ３＿７天 ，挑 取 ２０＿３０个 小 菌 丝 块 于 盛 有 １ ００ ２． ２ 培养基 ｍＬＰＤＢ液 体培养 基 的锥形 瓶 中 ， ２８℃ ， １５０ｒ ／ｒ ａｉ ｎ摇 ２． ２．１ ＰＤＡ培 养基 床震 荡 ６０ｈ后 ， 用 三 层 灭 菌 擦 镜 纸 过 滤 收集 菌 丝 马铃 薯 ２００ｇ煮 汁过滤 ， 葡 萄糖 ２０ｇ， 胰 蛋 白胨 ２ｇ。 酵母 提取 物 ２ｇ， 琼 脂 １０ｇ， 加去离子水定容至 体， 再用 ０． ６Ｍ 甘露 醇溶 液 冲洗 菌 丝体至 团状 。 ３．１． ２ 酶液 配制 １０００ｍＬ， ｐＨ值 自然 。 称 取一 定酶 ， 加人试管 中， 再 加 入 ５ ｍＬ０．６ Ｍ ２． ２．２ ＰＤＢ液体 培养基 的无 菌甘 露 醇 充 分 溶 解 ， 用 ０．２２ ｍ 微 孔 滤 膜 过 马铃 薯 ２００ ｇ煮 汁过滤 ， 葡 萄糖 ２０ ｇ， 胰 蛋 白胨 ２ｇ， 酵母 提 取 物 ２ ｇ， 加 去 离 子水 定 容 至 １０００ ｍＬ， ｐＨ值 自然 。 ２． ２． ３ 马铃 薯液 体再 生培 养基 滤。 ３．１． ３ 原生质 体 的配制 称 取上 述 菌 丝体 ０．５ ｇ于 ５０ｍＬ离 心管 中 ，加 入 ５ｍＬ配制 好 的酶液 ， 于 ２８＿＿３８ｃ Ｃ， 静 置 酶解 ２— 马铃薯 ２００ｇ煮汁 过滤 ， 葡 萄糖 ２０ｇ， 胰 蛋 白胨 ４ｈ。酶解 后 经脱脂 棉过 滤 ， 用 ０． ６１ Ｖ Ｉ甘露 醇 溶 液反 １ｇ， 酵母 提取 物 １ｇ， 甘露 醇 ０． ６ｌ， 加去离 子水 定容 复 冲 洗 ，收 集 滤 液 ，于 ４ ℃ ，３ ５００ ｒ ／ｒ ａｉ ｎ离 心 ２Ｏ 至 １０００ ｍＬ。 ａｉ ｒ ｎ， 弃上 清 ， 沉 淀 即为原 生质体 。 ２．２． ４ 马铃 薯 固体 再 生培 养基 ３．１． ４ 原 生质 体计 数 马铃 薯 ２００ｇ煮 汁过 滤 ， 葡萄糖 ２ ０ｇ， 胰 蛋 白胨 用适 量 的 ０． ６ｌ Ｖ ｌ甘露 醇 溶 液溶 解 原 生 质 体 ，用 １ｇ， 酵母 提取 物 １ｇ， 甘露 醇 ０．６１， 琼脂 １ ０ｇ， 加去 血球计 数板 计数 Ｊ 。 离 子水 定容 至 １０００ｍＬ。 ３．１．５ 原 生质体 产 率 ２． ２．５ 麦 芽糖 液体 再 生培 养基 麦芽糖 １ ０ｇ， 葡 萄糖 ４ｇ， 酵 母 提 取 物 ４ｇ，甘露 每 ｇ菌 丝体 产 生 的原 生 质体 数 量 ，以原 生质 体 个数／ｇ表 示 。 醇 ０．６ｌ， 加 去离 子水定 容 至 １０００ｍＬ。 ３． ２ 原 生质体 的制 备的条 件 ２．２． ６ 麦 芽糖 固体 再 生培养 基 ３．２．１ 茵丝 菌龄 麦芽 糖 １０ｇ， 葡 萄糖 ４ｇ， 酵母 提取 物 ４ｇ， 甘露 设 置 ５个 菌龄 时 间段 ： ３ ｄ， ４ｄ， ５ｄ， ６ｄ， ７ ｄ。５ 醇 ０． ６Ｍ， 琼脂 １ ０ｇ， 加 去离 子水定 容 至 １０００ｍＬ。 种 处理 在 同一次 实 验 中完成 ，以 减少 误 差 。 除菌 龄 ２． ２． ７ 纤 维二糖 液体 再 生培 养基 外， ５种 处 理 的其 他 条件 一 致 ： 用 ３．５％ 的溶 壁 酶加 纤 维二 糖 １ ５ｇ， 胰 蛋 白胨 ２ｇ， 酵母 提取 物 ４ｇ， １． ０％ 崩溃 酶酶解 ， 酶 解温度 ３６℃ ， 静 置酶 解 ２． ５ｈ。 甘露 醇 ０． ６ Ｍ， 加 去离 子水 定容 至 １００ ０ ｍＬ。 然后用血球计数板计数 ， 分别计算原生质体产率。 ２．２． ８ 纤维二 糖 固体再 生培 养基 ３． ２． ２ 酶 种 类及浓 度 纤维 二糖 １ ５ｇ， 胰 蛋 白胨 ２ｇ，酵母 提 取 物 ４ｇ， 进行 单 一酶及 不 同浓度 的溶 壁 酶 （２％ ， ２．５％ ， 甘 露醇 ０． ６Ｍ， 琼脂 １ ０ｇ， 加 去离 子 水 定 容 至 １０００ ３． ０％ ， ３． ５％ ， ４．０％ ）与 １．０％ 浓 度 的 崩 溃 酶 组 合 ， ｍ Ｌ。 共 ７组 处理 。每组 酶液 ５ｍＬ， 各加 人 ０．５ｇ菌丝 体 ， ２． ３ 试剂 进 行 酶解 ， 制 备 原 生质 体 。７种 处 理 的 其 他 条 件 一 溶壁酶 （Ｌｙ ｗａ ｌ ｌ ｚ ｙｍ）， 购 自广东 微 生 物菌 种研 究 所； 崩溃酶 （Ｄｒ ｉ ｓ ｅ ｌ ａ ｓ ｅ）， 购 自美 国 Ｓｉ ｇ ｍａ公 司 。 ０． ６Ｍ 甘露 醇溶 液 ： １ ０９．３２ｇ甘露 醇 ， 加 去离 子 水 定容 至 １０００ｍＬ。 致： 菌丝菌 龄 ６ｄ， 酶解 温度 ３６℃ ， 静 置酶 解 ２． ５ｈ。 然后用血球计数板计数 ， 分别计算原生质体产率。 ３． ２．３ 酶解 时 间 分 别设定 ５个酶解 时 间 ： ２ｈ， ２． ５ｈ， ３ｈ， ３． ５ｈ， ４ ４期 汪琪 ， 赵小龙 ， 陈平 ： 茯苓原生质体制备 与再 生条件 的优化 １３ ｈ。５种处 理 的其他 条件一致 ： 用 ３． ５％ 的溶壁酶加 １ ． 着茯苓 菌 丝菌龄 的增 大 ， 原 生 质 体 的产 率 也 逐 渐增 Ｏ％崩溃 酶酶解 ， 菌丝 菌龄 ６ｄ， 酶 解温度 ３６℃。然后 加， 在第 ６ｄ的时候 达到 最大 值 ３９．３８×１ ０４＂ ／ｇ（见 用血球计数板计数， 分别计算原生质体产率。 图１ ）， 随后产率开始下降。结果显示 ， 菌丝菌龄对 ３．２． ４ 酶解 温度 原 生质 体 的制备 有很 明显 的影 响 。对 于 菌龄过 小 的 设置 ６个 酶解 温 度 ： ２８℃ ， ３０℃ ， ３２℃ ， ３４℃ ， 菌丝 ， 菌 丝 细胞处 于 生 长 期 ， 细 胞 壁 比较 薄 弱 ，容 易 ３６℃ ， ３８℃ 。６种 处理 的其 他条 件 一致 ： 用 ３．５％ 的 被 酶解 ， 而 细胞膜 不成 熟不 完善 ， 导致 原生 质体 不稳 溶壁 酶加 １． ０％ 崩 溃 酶 酶 解 ， 菌 丝 菌 龄 ６ｄ，静 置 酶 定， 易产 生破 裂 ； 对 于 菌龄 过 大 的 菌 丝 ，菌 丝 细胞 已 解 ２． ５ｈ。然后 用 血球计 数 板计 数 ， 分 别 计算 原生 质 进 入稳定 期 或处 于稳定 期后 期 ， 这时 菌丝 老化 ， 细胞 体 产率 。 壁增 厚 ， 对 酶 的 敏 感 性 降 低 ，导 致 酶 解 过 程 难 以进 ３． ３ 原 生 质体 的再 生 行； 而处 于对数 时 期 的 菌丝 细 胞 最 有 利 于茯 苓 原 生 （１） 原生质体沉 淀中加入 ３ｍＬ液体再生 培养 基， ２８℃静 置 培养 ３ｄ。 质体 的释 放 ， 且原 生质体 的质量 、 活性 都最佳 。 表 １ 茵丝 菌龄对 茯 苓原 生质体 产 率的 影响 （２）将 培 养 物 倒 人 培 养 皿 中 ， 加 入 固体 再 生 培 养 基 于 ２５℃培养 ７ｄ。同时将 原 生质 体用无 菌 水进 行低 渗 处理作 为 原 生 质体 再 生 对 照 ，然后 用 同样 的 方法 涂 布于再 生 培养 基上 ， ２５℃ 培养 ７ｄ。 （ ３）统计每个平板上 长 出的菌落数 ， 计算再生 率。 再 生率 ％ ＝（再 生培养 基 上长 出 的菌 落数 一 低渗 处理 后 再 生 培 养 基 上 长 出 的 菌 落 数 ） ／涂 布 原 生 质 体 数 ×１ ００％ 【 ７ ３． ４ 原 生质体 的再 生 条件 ３． ４．１ 再 生培 养基 的成 分 分 别 用 三 种再 生培 养 基对 原生 质 体 进 行再 生 ： 马铃薯 、 麦 芽糖 及纤 维二 糖 再生 培养 基 。 ３． ４．２ 原 生质 体涂 布 方法 单层涂布法 ： 将培 养物倒人培 养皿 中， 加入 约 １ ０ｍＬ固体 再 生 培养 基 混 匀 ， 于 ２５℃ 培 养 ７ｄ。双 层涂 布 法 】： 将 培 养物 倒人 培养 皿 中 ， 加入 约 １ ０ｍＬ 固体再 生 培养基 混 匀 ， 冷 却 至 ５０ ａ Ｃ左 右 ， 待 其凝 固 后， 上 面再铺 约 １ ０ ｍＬ固体再 生 培养 基 。统 计 长 出 图 １ 最优 制备 条件释 放 的原 生质体 ４．１． ２ 酶种 类及 浓度 实验结果表明 （ 见表 ２）， 使用 ３． ５％溶壁酶 ＋ 的菌落 数 ， 计 算 再生 率 。 １． Ｏ％ 的崩 溃酶 时 ， 酶 解 效 果 最佳 ，获得 茯 苓 原 生 质 ３． ４．３ 酶 解 时间 体 的量最 高 。真 菌 细胞 壁 的成 分非 常复 杂 ， 使用混 分 别取 ２ｈ， ２． ５ｈ， ３ｈ， ３．５ｈ， ４ｈ的 原 生质 体 ， 合酶 进行 酶解 比单 一酶 的效 果更佳 。本 实验 所用 的 用 双层 涂布 法进 行再 生 实 验 。 统计 长 出 的菌 落 数 ， 溶壁酶为混合酶类 ， 本身效果不差 ， 加入其他酶类酶 计 算再 生率 。 解效果更好。当酶浓度达到一定时， 处于饱和状态 ， ４ 结 果 与分 析 不再 释放 原生 质体 ；当酶 浓度 过高 时 ， 酶 当 中一般 含 有一些对原生质体有害的酶类 ， 酶量增加时 ， 杂酶的 ４．１ 原 生质 体 制备条 件 的优化 浓度也会变高 ， 影响原生质体的活性 ， 并且还会使原 ４．１．１ 茵 丝茵龄 生质体 过 度酶解 而 变形 。 实 验结果 表 明 （见 表 １）， 从 培 养第 ３ ｄ开 始 ， 随 １ ４ 武 汉 轻 工 大 学 学惦 螗 报 辩 雄 垃 §ｏ ２ ０１ ５年 注： Ｉ代 表 溶 壁 酶 ； ｄ代 表崩 溃 酶 。 苓 原生 质体 的再 生率有 着相 当大 的差异 。用双层涂 ４．１． ３ 酶 解时 间 实验结 果表 明 （见 图 ２）， 在酶解 前期 ，随着 处理 布法 的效果 较 好 ，再 生 率 可 达 到 ３２．７％ ； 而单层涂 时间的延长 ， 所产 生的原生质体 的量 也随之增加 。 布 只有 １１．３％ 。 在 ２．５ｈ达 到最 大 值 为 ３９．３８×１ ０－ ￣－ ／ｇ，随 后其 值 ４．２． ３ 酶解 时间 ∞站 ； ； ｝ ∞鹞 ∞ ｏ 开始 下降 ， 但在 ３ｈ时 ， 下 降 的不 明显 。茯苓 菌 丝 在 实 验结果 显示 （见 图 １）， 随着 酶解 时 间 的延长 ， ２．５．＿３ ｈ之 间 已得 到充 分 的 酶解 ， 原 生质 体 释 放 完 原 生质 体再 生率 也 不 断 下 降 。而 在 ３ｈ之前 ，下 降 全 。时 间过 短 ， 会 导致脱 壁 不全 ； 过长 酶解会 造 成原 的幅度 较小 ； 超过 ３ｈ之后 ， 开 始 大 幅度 的下 降 。原 生质体破裂或者溶解 ， 使原生质体的数 目减少＿ ｌ 。 。 。 生质体 需要 一定 的 活性才 能再生 ， 酶 解 ３ｈ之 后 ， 原 生质 体受 到 的伤害 大 幅 度增 加 ，活性 也 大 幅 度 的 降 低， 因此 难 以再生 。 ５ 讨论 蓄 酶解法制备原生质体是最普遍 的一种方法。本 研 究从 ８个 方面探 讨 了原 生 质 体 的制 备 与 再 生 ， 得 出结论 ： 采 用培养 ６ｄ的茯苓 菌 丝 ， 在 ３．５％ 溶壁 酶 耋 ５ ｌ 誊 蕊 毒 ｔ ／ ｄ ●一原生质体产率 — 愿生质幡再生率 图 ２ 酶 解 时 间对 茯苓 原 生质体 产率 和再 生影 响 ４．１． ４ 酶解 温度 实验 结果 表 明（见表 ３）， 在 酶解前 期 ， 随着 酶 解 温 度上 升 ， 原 生质体 的得率也 不 断增加 ，当酶解温 度 达 到 ３６℃时 ， 产量 最 大 ，为 ３９．３８×１ ０’＋／ｇ。 随后 原 生质 体 的产量 开 始 下 降 。实 验 使 用 混合 酶 类 ，不 同的酶 活性 最强 时 的温度 也有 所不 同¨¨。 表 ３ 酶 解温 度对 茯苓 原 生质体产 率 的影 响 ＋１％崩溃 酶 的混合 酶液 中 ， ３６ｃ Ｃ酶解 ２．５＿ ３ｈ， 获 得 的原生 质体 产量 最高 ， 可达 到 ３９． ３８×１ ０＋／ｇ， 双 层涂 布再 生率 可达 ３２． ７％ 。 程水 明等 从酶 解温度 、 酶 液浓度 、 酶 解 ｐＨ、 酶解 时间 ４个条 件研究 茯苓 原生质 体 的最佳 制备 ，以 ５＿７天菌丝 为材 料 ， ０．６Ｍ 甘 露 醇 作 为渗 透 压 稳 定 剂， ｐＨ５．５＿＿６． ０， 在 ２％酶 液 的作 用 下 ， ４１℃水 浴 酶 解 ３ｈ， 可得 到 １． ７×１ ０ ／ｇ的原 生 质体 。笔 者所 做 的与其相 比酶解采 用混 合酶 ， 产量 大 大得 以提高 。 梁清 乐等从 最适 菌 龄 、 酶 液 浓 度 、酶 解 时 间 、 稳 定剂 ４个 方 面对 茯 苓 原 生 质体 制备 与再 生进 行 了探 究 ， 得 到结果 以 ５６—７２ｈ菌 丝 为材 料 ， ０．６１ Ｖ Ｉ甘露 醇 作 为 渗透压 稳定 剂 ， 在 ３％溶 壁 酶 ＋３％ 蜗 牛 酶 的作 用 下， ２８ｃ ｃ震 荡 酶解 ２．０＿２．５ｈ，最 高 可 得 到 ６．５× １ ０／ｇ的原生质体口引。与之相 比， 笔者研 究 ｐＨ对 ４．２ 原 生质 体 的再 生条件 原生 质体制 备 的影响 ， 酶 的应用 也有 所改 变 ， 也 大大 ４． ２．１ 再 生培 养基 的成 分 提高 了茯苓原 生质体 的产量。王伟霞等 实验 结果 表 明 ，三种 不 同 的培 养基 对 茯 苓原 生 茯 苓 原生质 体 的制 备进 行 了探 究 ， 但 其 产 量 和再 生 质体 的再生 能力 几乎 没有 差异 。 率都 不及 笔者 的研究 结果 。 ４． ２． ２ 原 生质 体涂 布 方法 参 考文 献 实 验结 果 发 现 ， 单层 涂 布 与 双层 涂 布 所得 的茯 也对 ［１］ 国家药典委 员会．中华人 民共和国药典 ［ ｓ］， ４期 汪琪 ， 赵 小龙 ， 陈平 ： 茯苓原生质体制备与再生条件 的优化 １ ５ ｍａ ｒ ｋｅ ｒ［Ｊ］．Ａｇｒ ｉ ｃ ｕｌ ｔ ｕｒ ａ ｌＳｃｉ ｅ ｎｃｅ＆ Ｔｅ ｃｈｎｏｌ ｏ ｇ ｙ， ２０１０： ４６． ［ ２］ 章佩芬 ，罗焕敏．飞扬草 药理作 用研 究概 况 ［ Ｊ ］．中药材 ， ２ ０ ０５， ２ ８（ ５）： ４３ ７ ４３ － ８． ２ｏ０８， ９（３）： ５９４５ ２． ［１ ０］ 杨迎 青， 李 明海 ， 杨媚 ， 等．水稻纹枯病 菌原 ［ ３］ 蔡 丹凤 ，陈美元 ， 郭 仲 杰 ，等．茯 苓 菌株 生物 学 特性 的 研 究 ［Ｊ］．中 国食 用 茵 ， ２００９， ２８（１）： 生质 体制 备 与 再 生 条 件 的 优 化 ［Ｊ］．华 中农 业 大学 学报 ， ２０１０， ２９（５）． ［１ １］ ＤＥ—ＢＥＫＫＥＲ Ｃ，Ｗ ＩＥＢＥＮＧＡ Ａ，ＡＧＵＩＬＡＲ Ｇ ， ２３－ ２６． ［ ４］ 刘 祖 同 ，罗 信 昌．食 用 茵 生 物 技 术 及 应 用 ｅｔａ１．Ａｎ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｃｋｔ ａｉ ｌｆ ｏｒ ｅｆ ｉ ｃｉ ｅｎｔ ｐｒｏｔ ｏ— ［Ｍ］．北京 ：清华 大 学 出版社 ， １９９９： ８６． １ ２４． ｐｌ ａ ｓ ｔｆ ｏｒ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎｉ ｎＡｓ ｐｅ 哂ｌ ｌ ｕｓ ｎｉ ｇｅ ｒ［Ｊ］．Ｊｏ ｕｒ ｎａｌ ［ ５］ 邱龙 新 ．食 用茵 原 生质 体 技 术研 究现 状 ．龙 岩 ｆ Ｍｉ ｏ ｃｒ ｏｂｉ ｏ ｌ ｏｇ ｉ ｃａ ｌＭｅｔ ｈｏ ｄｓ， ２００９， ７６（３）： ３０５— 师专学报 ［ Ｊ ］， ２ ０ ０２， ２ ０（ ６）： ４９ － ５１． ３０６． ［ ６］ 朱 坚 ，张鹏等 ．白灵 菇 原 生质 体 制备 条 件 的优 化［ Ｊ］ ．中国农 学通报 ， ２ ０１ ｌ， ２ ７（ ２５）． ［７］ 陈亮 ， 孙庚 午 ， 王 洪凯 ， 等 ．葡萄座 腔 茵原 生质 体的制备及 的 转 化 ［Ｊ］．林 业 科 学 ， ２０１ ４ ［１ ２］ 程 水 明 ，周 导 华．茯 苓 茵丝 原 生质 体 最佳 条 件 研 究 ［Ｊ］．安徽 农 业 科 学 ， ２００６，３４（１ ８）： ４６５ｌ－ ４６６６． ［１ ３］ 梁 清 乐 ，王 秋 颖 ，曾 念 开 ，等．茯 苓 灭 活 原 生 质 体 融 合 育 种 研 究 ［Ｊ］．中 草 药 ， ２００６，３７ （ ６）． ［ ８］ 王 杰 ，林俊 芳 ，云 慧 ，等．草 菇 原 生质 体 制 备 、 再生及 转 化研 究 ［ Ｊ］ ．华 南农 业 大 学 学报 ， （５）． ［１ ４］ 王伟 霞 ，李 福 后．茯 苓 原 生质 体 制 备 与 再 生 条件 的研 究 ［Ｊ］．茵物研 究 ， ２００６， ４（ ４）． ２００７， ２８（３）． ａ ｂ— ［ ９］ Ｗ ＡＮ Ｙ ，ＺＨＡＮＧ Ｄ Ｊ，ＨＵＡＮＧ Ｙ ，ｅｔａ１．Ｅｓｔ ［１ ５］ 吕龙 ，郭 成 金．正 交设 计 法探 讨 茯 苓 原 生 质 ｌ ｉ ｓ ｈｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒ ｏｔ ｏｐｌａｓｔ ｔ ｒａｎｓｆ ｏｒｍａｔ ｉ ｏｎ ｓｙｓ ｔ ｅｍ ｉ ｎ 体的最佳制备条件［ Ｊ］． 天津师范大学 学报 ， Ａｈｅｍ ａｒｉ ａ ｔ ｅｎｕｉ ｓｓｉ ｍａ ｕｓ ｉ ｎｇ Ｇ４１８ ２００７， ２７（ ３）． ｓｅｌ ｅｃｔ ｉ ｏｎ