双氢青蒿素对狼疮性BXSB小鼠的作用.pdf

·１９· ·论著· 双氢青蒿素对狼疮性ＢＸＳＢ小鼠的作用 徐丽敏１，陈学荣２，屠呦呦３ 天津市长征医院，天津３０００２１；２．北京大学第三医院皮肤科，北京１０００８３ ３．中国中医药研究所，北京１００７００） 摘要：目的探讨双氧青蒿素治疗红斑狼疮的机理。方法选择雄性ＢＸＳＢ小鼠５０只．分成空白组（生理盐水）、 对照组（强的松）和实验组（双氢青薅素）．采用Ｍａｃａｒｔ和直接免疫荧光方法检测ＢＸＳＢ小鼠碌蛋白、脾脏Ｔ细胞亚群 祁Ｂ细胞，结果ＢＸＳＢ小鼠尿蛋白量依次减低为空白组＞实验组＞ｘ４照组，Ｐ＜０．０ｌ。对照组的ＣＤ。Ｔ细胞和ＣＤ８ Ｔ细 胞低于空白绀，Ｐ＜Ｂ．０５。实验组的ｃＤＪ细胞和ＣＤｓＴ细胞高于空白组，Ｐ＜０．叭。Ｂ细胞降低顺序为空白组＞实验组＞对 嬲组．Ｐ＜Ｏ ０１。结论双氧青蒿索通过抑制Ｂ淋巴细胞增殖，促进ＣＤ４Ｔ细胞和ＣＤＲＴ细胞的增殖，尤其是ＣＤｓＴ细胞 增殖明显．减少Ｂ细胞分泌自身抗体，从而达到治疗红斑狼疮的作用。 关键词：双氢青蒿索；ＢＸＳＢ小鼠；红斑狼疮 中图分类号：Ｒ５９３．２４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２—０７０９（２００２）０１—００１９—０２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｙｄｒｏａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ ｏｎ Ｌｕｐｕｓ ＢＸＳＢ Ｍｉｃｅ ｘｕ Ｌｉ—ｒａｉｎ ７．ＣＨＥＮ Ｘｕｅ—ｒｏｎｆ ＴＵ Ｙｏｕ—ｖｏｔ， １．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＤｅｒｎｗｔｏｌｏｏ＇，Ｔｉｗｔｊｉｎ Ｃｈａｎｇｚｈｅｎｇ ｌｌｏｓｐｎ以Ｔｉａ，０ｉｎ ３０００２１．Ｃｈｉｎａ，．２ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆＤｅｒｎｍｔｏｌｏｇｙ，ｎｉ坷 Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３，Ｃｈｉｎｏ；３．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｅｉｎｅ ｏｆ Ｃｈｉｎａ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００７００，Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｆｉｖｅ １＇ｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｈｙｄｍａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｅｒｖｔｈｅｍａｔｏｕｓ ｌｕｐｕｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＢＸＳＢ ｍｉｃｅ ｎｅＨｌ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｒｅｅ ｇｍｕｐｓ：ｂｌａｎｋ ｇｒｏｕｐ．ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ５０ Ｕｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ．ＣＤ，Ｔ ｃｅｌｌ． ＣＤ目Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｂ ｅｅｌｌ ｉｎ ｓｐｌｅｅｎ ｏｆ ｔｈｅ １１１ａｌｅ ｌｕｐｕｓ ＢＸＳＢ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ２ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｍａｃａｒｔ ａｎｄ ｌｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｇｅｅｌ＇ｔｃｅ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｕｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｇｒｏｕｐｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｏｒｄｅｒ ａｓ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ＞ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）ｔｈｅ ｅｏｎｔｒｏＩ（Ｐ＜Ｏ，０１）．Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ Ｃ１３ｌ口ｃｅｌｌ ａｎｄ ＣＤＩＦ ｃｅＵ血ｔｈｅ ｅｏｕｔｍｌ ｇｒｏｕｐ ｗｅｍ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ｇｒｏｕｐ （Ｐ＜０ ０５ Ｊ，ａｎｄ ｉ１１ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｔ｝ｌｅ ｂｌａｎｋ（尸ｔＯ．０１）Ｉ＇ｂｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ Ｂ ｃｅｉｌｓ ｉｎ ｌｈｅ ｔｈｒｅｅ ｇｒｍａｐｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｏｒｄｅｒ，Ｋｓ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ＞ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ＞ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐ＜Ｏ．０１）Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｈｖ＿ ｄｒｏａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ…ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｐｍｌｆｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈｍｕｇｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ １ｅｖｅｌ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ａｕ ｏａ ｍｄｙ ｏｆ Ｂ（：ｅｌｌｓ．ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ Ｏｎ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ ｌｕｐｕｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｈｖｄｌＤｕｎｅｍｉ目Ｉｌｉｎ：ＢＸＳＢ ｎｄｅｅ；ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ 双氢青蒿素是从菊科植物提取出来的一种新 型的倍半萜内脂，是一种速效低毒药物。曾用于治 光显微镜等。 １．３给药方法和剂量 疗盘状红斑狼疮，获得一定临床效果，但药理机制 每天１次灌胃。双氨青蒿素：高剂量（Ｈ）：５０ 研究未见报道。本文将选择系统性红斑狼疮（ＳＬＥ） ｒａｇ／（ｋｓ·ｄ）。中剂量（Ｍ）：２５ ｍｇ／（ｋｇ·ｄ），低剂量（Ｌ）： 模剐ＢＸＳＢ小鼠，研究双氢青蒿素对ＢＸＳＢ小鼠免 １２．５ ｍｇ／（ｋｇ·ｄ）；强的松６．３ ｍｇ／（ｋｇ·ｄ）。 疫系统的影响。 １．４疗程 １材料与方法 １－１ 连续给药４５ ｄ。 动物和药·｝占 １．５实验方法 ＢＸＳＢ小鼠引自美罔Ｊａｃｋｓｏｎ实验室，北京医科 选择ＢＸＳＢ雄性小鼠，体重２２～２５ ｇ，１０—１１周 大学动物室饲养繁殖。双氢青蒿素由中国中医研究 龄，共５０只。分３组，即空白组（１０只），对照组（强 院中药研究所提供。强的松。 的松组一ｌｏ只），实验组（双氢青蒿素组３０只：Ｈ— 主要试剂和仪器 １０只，Ｍ—１０只，Ｌ—１０只）。 十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ），ＣＢＢＧ２５０，标准蛋白试 １．５．１尿蛋白测定压迫膀胱取鼠尿。分别在用药 剂，ＯＫＴ。（ＣＤ。）和ＯＫＴ。（ＣＤｓ）单克隆抗体，ＦＩＴＣ一抗 前、用药后１５ ｄ、３０ ｄ、４５ ｄ取鼠尿。采用Ｍａｃａｎ法 鼠Ｉｇ抗体，鼠淋巴细胞分离液。紫外分光光度仪，荧 测定：将尿液１００灿加４肛Ｌ含ＳＤＳ的ＣＢＢＧ２５０， １．２ 万方数据 融ｔｈ蕊 中闰中两医结合皮肤性病学杂志２００２午第１卷第１期 混匀，窒温２０ ｒａｉｎ。以标准蛋白液为对照，在紫外分 表２ 荧光盅徽镜下Ｔ细胞亚群分类及Ｂ细胞计数（ｉ蜘） 光光度仪６００ ｎｍ光吸收值检测。 １．５．２脾脏单一核细胞制备将用药４５ ｄ的小鼠 处死，取脾研磨。过滤。用鼠淋巴细胞分离液分离单 一核细胞，ＰＢＳ液洗涤２次，用含５％小牛血清的 ＰＢＳ液将细胞制成（２～３）ｘ１０６／ｍＬ细胞悬液，待用。 Ｔ细胞亚群分类取细胞悬液置于两个小离 １．ｓ－３ 心管中，离心５ ０００ ｒ／ｍｉｎ，弃上清液，分别加入单克 隆抗体ｏＫＴ４（ＣＤ。），ＯＫ’１＇８（ＣＤ。），４ ｏＣ ３０ 空白组与对照组和实验组比较：¨Ｐ＜０．０１，＋Ｐ＜０．０５ 后的重组近交品系。ＢＸＳＢ小鼠由于Ｙ染色体连锁 ｒａｉｎ，离心， 的自身免疫增强子Ｙａａ基因的作用．雄鼠发病早， 加荧光洗液，洗涤２次后，加荧光抗体，４屯３０ ｍｉｎ， 雌鼠发病晚。病情随月龄增加而加重。ＢＸＳＢ小鼠有 再用荧光洗液洗涤２次，加荧光保存液，保存在４ 类似人ＳＬＥ临床表现。表现淋巴结肿大，脾肿大，免 ｃｃ。在荧光显微镜下观察计数。 疫复台物肾小球基底膜沉积“…。Ｔ淋巴细胞对ＳＬＥ 取细胞悬液，直接用ＦＩＦＣ一抗 产生和发展有直接影响，表现ＣＤ。细胞能辅助Ｂ细 小鼠Ｉｇ抗体于细胞悬液中，４℃静置３０ ｍｉｎ。细胞 Ｂ细胞检测 胞合成自身抗体，ＣＤ。抑制自身抗体产生”１。发病的 经ＰＢＳ（０．１ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．４，含５％／ｂ牛血清）３７℃预 雄性ＢＸＳＢ小鼠Ｂ淋巴细胞的增殖速度升高，而凋 温，洗涤２次，荧光显微镜下观察计数。 亡速度显著降低，Ｂ细胞更新速度决定ＢＸＳＢ小鼠 １．６统计学处理采用美国微软Ｐｒｉｍｅｒ统计软件 脾脏Ｂ淋巴细胞生长速度大于消灭的速度，导致外 进行方差分析，Ｆ检验。 周Ｂ细胞总数增加。这样使小鼠的淋巴细胞处于高 ２结果 比例的级联状态，产生大量免疫球蛋白，而发生自身 １．５．４ ＢＸＳＢ小鼠用药前后与空白组屎蛋白检测结果 ２．１ 实验组和对照组均随用药时间的延长其ＯＤ值 本研究结果，双氢青蒿素实验组，阻止Ｂ淋巴 细胞增殖，对Ｔ淋巴细胞的影响主要是促进ＣＤ。Ｔ 与空白组尿蛋白含量比较，经统计学处理Ｐ＜０．０１， 细胞增殖，说明双氢青蒿素直接和间接抑制Ｂ淋巴 有显著的统计学意义。对照组优于实验组，在实验 细胞活性，从而减少免疫球蛋白自身抗体产生，达到 组中，双氢青蒿素高剂量的结果与中等剂量相同， 治疗ＳＬＥ的作用。其作用没有剂量的依赖性。ＢＸＳＢ 低剂量的效果不如中剂量，见表ｌ。 小鼠肾脏免疫球蛋白的沉积减少表现尿蛋白含量下 Ｍａｃａｒｔ法检测ＢＸＳＢ小鼠屎蛋白（０１）值） ｆｆｌ』＿＠ｉｆ～可Ｊ雾—丽 ｎ 免疫球蛋白减少，从而起到双向调节免疫功能，降低 体液免疫反应，减轻免疫复合物的形成，有利于病情 的恢复。同时还可以观察强的松对Ｔ淋巴细胞和Ｂ ８９ １±３ ４２ ９０ ６±２ ２７ １０ ８８．８±３ ５１ ８３ ４工５ ８２＊７９ 宾验组Ｈ ｌＯ ８９ ６±３ ７２ ８６ ３±３ ４４＋８０．９±３ Ｍ １０ ８９ ４±３ ２５ ８６ ３±４ ３２４ ８２ ２±３ ５９＋＋７８ Ｌ ｌＯ ８９ ２工２９９ ８９ ８±１ ９８ ９２．３±３ ５６ １５料７６．４±３ ０９＋｝ ８＝３．１１｛＋ Ｔ细胞亚群分类和Ｂ细胞检测结果 ＣＤ。淋巴细胞表现，对照组明显低于空白组，实 验组的中、高剂量组升高明显；ｃＤ。淋巴细胞表现， 对照组也低于空白组，实验组的中、高剂量组明显 升高；统计。ｐ－处理Ｐ＜Ｏ．０５。Ｂ淋巴细胞，对照组和实 验组都明显低于空白组，经统计学处理Ｐ＜０．０１，有 显著统计学意义，见表２。 ３讨论 ＢＸＳＢ小鼠是雌性Ｃ５７ＢＬ和雄性ＳＢ小鼠杂交 ． 淋巴细胞均有较强的抑制作用，提示长期应用强的 松治疗ＳＬＥ时，可能出现不可逆的副作用或死亡。 ９１．４±７．９１ 空白组与对照组、实验组比较：ｔ￥心０ ０１．ｍＰ＜０ ０５ 万方数据 ＢＸＳＢ小鼠的Ｔ淋巴细胞，下调Ｂ淋巴细胞，意味着 ７±３“¨６３ ３±２ ８８＋｛ ｌＯ 对照组 ２．２ 降，也表明双氢青蒿素治疗效应。双氢青蒿素上调 １１０ ３±３ ８６＊＋１１９ ３±３ ５６¨ 空白组 Ｉ 免疫性疾病ＳＬＥ［４』】。 降低，尿蛋白含量明显低于宅白组。实验组、对照组 表Ｉｔ · 参考文献： ‘ｌ：ｈＵｉ ｓ、ＭｃＣｏａａｈｅｙ ＰＪ，Ｄｉｘｏｎ Ｕ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓ∞ｎｔ｜ｍｅ“８ ｐｏｌｙｃｌｏｎＭ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｌ“ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａ即（Ｊ］．Ｊ ｈｎｍｕｎｏｌ，１９７８、１２１：２２１３ ＇２ ２ Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｕｓ ＡＮ ｌｏｇｉｃａｌ ＳＬＥ［Ｊ］ｈｎｍｕｎｏ— Ｅｔｉｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ Ｒｅｖ，１９８１，５１（１７９）：６３ ［３ｊ Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ Ｙ－Ｔｏｎｅｒ Ｙ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｌｍｍｕｎｅ‘ｔｉｓｅａｓ…ｉｔｈ Ｔ—ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌ：ｌｅｓｓｏｎ ｆｒｏｍ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＳＩ Ｅ ｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ＥＡＥ［Ｊ］Ｉｍ— ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９３，３６：１０９ Ｌ４］张业东，邓鸿业，邓玉兰，等ＢＸＳＢ小鼠外周Ｂ淋巴细胞异常增生 的研究［Ｊ］中华微生物免疫学杂志，１９９７，１３（２）：３２４ ［５］绦志伟，邓鸿业，昊国庆，等狼疮性ＢＸＳＢ小脾脏淋巴细增殖与 凋亡的初步分析（Ｊ］免疫学杂志．２００２，２２（３）：１７２． （收稿日期：２００２＿０９≈５修回日期：２００２—１０－１６】 １ 双氢青蒿素对狼疮性BXSB小鼠的作用 作者： 徐丽敏， 陈学荣， 屠呦呦 作者单位： 徐丽敏(天津市长征医院,天津,300021)， 陈学荣(北京大学第三医院皮肤科,北京,100083) ， 屠呦呦(中国中医药研究所,北京,100700) 刊名： 中国中西医结合皮肤性病学杂志 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF DERMATOVENEROLOGY OF INTEGRATED TRADITIONAL AND WESTERN MEDICINE 年，卷(期)： 2002,1(1) 被引用次数： 14次 参考文献(5条) 1.徐志伟;邓鸿业;吴国庆 狼疮性BXSB小脾脏淋巴细增殖与凋亡的初步分析[期刊论文]-免疫学杂志 2002(03) 2.张亚东;邓鸿业;邓玉兰 BXSB小鼠外周B淋巴细胞异常增生的研究 1997(02) 3.Shoenfeld Y;Toner Y Manipulation of autoimmune diseases with T-suppressor cell: lesson from experimental SLE and EAE[外文期刊] 1993 4.THEOFILOPOULOS AN Etiopathogenesis of murine SLE[外文期刊] 1981(179) 5.IZUI S;McConahey PJ;Dixon FJ Increased spontaneous polyclonal activation of lymphocytes in mice with spontaneous autoimmune disease 1978 引证文献(15条) 1.丁焕新.李镜锋.陈旭明.李立 天然药物青蒿素及其衍生物的作用机理研究进展[期刊论文]-中国普外基础与临床 杂志 2010(5) 2.孙晓杰.李铁男.陈晴燕.郭长占.金春林.陈家惠.孙昂远.林庶茹.孙晓东 扶正汤对MRL/1Pr红斑狼疮小鼠模型免疫 器官及生活质量的影响[期刊论文]-中国中西医结合皮肤性病学杂志 2010(3) 3.王红.姜波.张华勇.刘布骏.孙凌云 青蒿琥酯通过抑制ICAM-1治疗鼠狼疮性肾炎的研究[期刊论文]-实用临床医药 杂志 2010(17) 4.金鸥阳.赵盛楠.徐婷.王杰.周康兴.孙凌云 青蒿琥酯治疗MRL/lpr狼疮鼠的疗效及机制研究[期刊论文]-中华风湿 病学杂志 2008(3) 5.吴玮.范瑞强 中医药治疗系统性红斑狼疮的研究集要[期刊论文]-世界中医药 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